耐热蛋白酶产生菌的酶学性质研究-博迅灭菌器使

蛋白酶在科学研究和工业生产等方面应用广 泛（唐兵等，2000），其主要产自微生物，但在高温、 强酸、强碱、多金属离子等条件下酶的催化活性并 不好，常有失活情况发生（林影等，2000）。 高温蛋 白酶的应用前景十分广阔（廉立慧等，2011），但国 内对高温蛋白酶产生菌的研究相对较晚， 对高温 蛋白酶催化活性方面的研究还鲜有报道。

1 材料和方法 

1.1 试验材料 

1.1.1 土壤样品 

土壤样品来自大理弥渡县白总 旗热泉的底泥，热泉水温 55 ℃。 

1.1.2 主要仪器 

显微镜（奥林巴斯）；紫外可见 光分光光度计（上海菁华仪器公司）；高速冷冻离 心机（上海安亭科学仪器公司）；恒温培养箱（上海 一恒科学仪器有限公司）；水浴恒温摇床（常州国 华电器有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；超净工作台（苏州净 化设备有限公司）；PCR 扩增仪（美国 ABI）；电泳 仪（北京六一生物科技有限公司）。 

1.1.3 试剂 

酵母抽提物、蛋白胨为英国进口；琼 脂粉为西班牙进口分装；脱脂奶粉、三氯乙酸、folin 试剂、浓盐酸、干酪素、氯化钠、结晶紫、碘、乙醇、 孔雀绿、番红等均为国产分析纯试剂。DNA 抽提试 剂盒、PCR 扩增试剂盒、 胶回收试剂盒和 DNA 分 子量标准品均购自北京天根生物技术有限公司。

1.1.4 培养基 

脱脂奶粉培养基：脱脂奶粉 50 g， 水 500 mL，琼脂粉 10 g，100 ℃灭菌 20 min。 LB 液体培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，NaCl 10 g， 超纯 水 1000 mL， 调 pH 至7.2， 121 ℃灭菌 20 min。 发酵产酶培 养基：豆粕 20 g，葡萄糖 1 g，蒸 馏水 200 mL，121 ℃灭菌 20 min。 

1.2 试验方法 

1.2.1 菌株富集 

称取白总旗热泉底泥 2 g 于 45 mL 的无菌蒸馏水中，150 r/min，振荡 15 min。在无 菌条件下， 用移液枪吸取 5 mL 悬液于 50 mL 的 富集培养基中，将接种好的富集培养基置于 55 ℃， 转速为 150 r/min 的水浴恒温振荡培养箱中振荡 培养 24 h。 

1.2.2 菌株初筛 

将富集好的菌液稀释至 10-3 、 10-6 、10-9 倍， 用移液枪分别吸取稀释的菌液 150 μL 接种在筛选培养基平板上，涂布均匀。 于 37 ℃倒 置培养 24 h。 观察菌落周围若有水解圈出现，说 明该菌株能产生蛋白酶。 

1.2.3 菌株复筛 

将初筛得到的菌株取少量接种 于种子瓶（LB 液体培养基），55 ℃培养 24 h 后，将 种子液按 2%的接种量接入到发酵培养基，55 ℃、 150 r/min 水浴摇床培养一周。 离心取上清测酶活。

2 结果与分析 

2.1 产酶菌株的筛选 

根据水解圈直径与菌落 直径比值的大小。筛选到 3 株产高温蛋白酶菌株。 其中 1 号菌株 水解圈直径 与 菌 落 直 径 比 值（R1/ R2）最大。 经复筛发现 3 株菌均为分泌型蛋白酶 产生菌，且 1 号菌株酶活最高，为 49.99 U/mL，与 初筛的结果相符。因此，选择 1 号菌株作为后续试 验研究菌株，命名为 Pro-55。 

2.2 菌种鉴定 

2.2.1 形态学、 生理生化特征 

Pro-55 在 LB 培 养基上 37 ℃培养 72 h 后， 菌落形态呈圆形，黄 色，不透明，黏稠，光滑，表面湿润，中间隆起，边缘 整齐， 菌落整体较小未产菌丝。 革兰氏染色呈阳 性，端生芽孢，鞭毛染色后未观察到鞭毛。 对 Pro-55 的生 理 生 化 特 性 进 行 研 究 发 现， V-P 试验、甲基红试验、蔗糖发酵试验结果均为弱 阳性。明胶试验、吲哚试验、乳糖发酵试验、葡萄糖 发酵试验结果均为阴性。 

2.2.2 16S rRNA 基因序列及系统发育分析 

16S rRNA 基因测序， 所获得的序列长度为 1438 bp， 将 Pro-55 的 16S rRNA 基因 序 列 与 GenBank 数 据库中的序列进行同源性比对，发现 Pro-55 与短 芽 孢 杆 菌 属 的 16S rRNA 基 因 序 列 自 然 聚 类 ， Pro-55 的 16S rRNA 基因序列与 16 条相似性较 高的序列构建系统发育树见图 1， 从图中可以看 出 Pro -55 与 Brevibacillus sp. FJAT -21992 （KP728965.1）菌株聚为一群，相似性也最高，表明 Pro-55 与 Brevibacillus sp.的菌株亲缘关系最近。 根据 Pro-55 的形态及生理生化特征， 结合 《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）（布坎南，1984）， 以及 Pro-55 16S rRNA 基因序列及系统发育树， 将 Pro-55 初步鉴定为短芽 孢杆菌属（Brevibacillus sp.） 的一 株 菌， 命 名 为 Brevibacillus sp.Pro

2.3 菌种的最适生长温度 

按照试验方法，在波 长 600 nm 处测定不同温度培养下 LB 培养基的 吸光值，以 600 nm 处的吸光值为纵坐标，温度为 横坐标作温度—吸光值关系曲线，结果如图 2。

从图 2 可知，25 ～ 43 ℃菌株的生长量随着温 度 的 升 高 而 增 加，43 ℃时，LB 培养 基 在 600 nm 下的吸光值最高，表明 43 ℃是菌株的最适生长温 度。 45 ℃以后，菌株生长量随着温度的升高而下 降，菌株在 55 ℃下仍能生长，表明菌株属于典型 的耐高温菌。

3 结论 

高温蛋白酶是一类广泛应用于医药、食品、日 用化工等方面且有着巨大开发潜力的酶， 在微生 物体内广泛 存在 （徐辉 艳 等，2009； 胡青 平 等， 2005）。 本次试验得到的菌株经分子鉴定为短芽 孢杆菌；其最适生长温度为 43 ℃，酶反应最适温 度 40 ℃，酶反应最适 pH 为 6.0，在最适反应温度 下酶活力为 36.74 μg/mL； 在 37 ℃以下酶具有较 好的热稳定性。 Ca2+ 、Zn+ 、Mg2+ 、Cu2+ 等离子对酶液 的酶活性均有促进作用， 同时酶液具有很强的离 子耐受力。本文所筛选菌株在 55 ℃高温下依然具 有较强的酶活力，且温度耐受性较强。 

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