小菌虫肠道可培养细菌的分离鉴定(YXQ-50SII使用

昆虫肠道中存在多种细菌，有调控寄主生长发 育、影响寄主免疫、协助寄主消化食物等功能［１－３］。 特别对白蚁来说，其对食物中木质纤维素的降解要 依赖于自身酶系及其体内肠道微生物来共同完成［４］。 小菌虫 （Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｌａｅｖｉｇａｔｕｓ）是 世界 性 分 布 的 储粮害虫，我国大部分地区均有分布［５］，其 成虫 体 长４．０～５．０ｍｍ，长椭圆形，黑褐色，有光泽，全 身密 生 黄 褐 色 短 毛， 触 角 有 １１ 节， 棍 棒 状， 自 第７节开始 向 内 侧 扩 展 而 形 成 锯 齿 状。复 眼 较 小， 从侧面看，复眼被头部向后突出的侧片所分割，其 最狭处约等于１个小眼面的宽度，鞘翅上有细毛与 刻点组成的纵点行。

１ 材料与方法

１．１ 实验材料

１．１．１ 供试虫体

供试小菌虫来源于山东第一医科 大学 （山东省医学科学院）病媒生物与虫媒病实验室， 美洲大蠊共同饲养，饲养条件为温度 （２６±１）℃、相 对湿度 （６０±１０）％、光 照１２∶１２ （Ｌ∶Ｄ），提 供 兔饲料作为食料。

１．１．２ 主要仪器和试剂

生物安全柜 （苏州安泰空 气技 术 有 限 公 司），ＰＣＲ 扩 增 仪 （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ－ ｔｅｍｓ公司），水 平电 泳 槽 （北 京 君 意 东 方 电 泳 设 备 有限公 司），培 清ＪＳ－６８０Ｄ 全 自动凝胶成像分析仪 （上海培清科技有限公司），博迅YXQ-50SII立式压力蒸汽灭菌器 （上海博讯实业有限公司医疗设备厂），高精 度数显 恒 温 水 浴 锅 （常州智博瑞仪器制造有限公 司），牛肉 浸 膏 （天津市英博生化试剂有限公司）， 琼脂、酪蛋白、刚果红、台盼蓝、细菌基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 （北京索莱宝科技有限公司），可溶性淀粉、溴甲酚紫 （天津市凯通化学试剂有限公司），聚 乙烯醇 （ＰＶＡ）（上海源叶生物科技有限公司），羧 甲基纤维素钠 （ＣＭＣ）（青州市清泉纤维素厂），橄 榄油 （辽宁晟麦实业股份有限公司）等。

１．２ 方法

１．２．１ 培养基的配置

牛肉膏蛋白胨培养基 （ＮＡ 培养基）：牛肉膏１．５ｇ，蛋白胨５．０ｇ，ＮａＣｌ２．５ｇ， 琼脂 １０．０ｇ，加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ５００ ｍＬ，调 节 ｐＨ 值为７．０～７．４，１２１ ℃高 压灭 菌２０ｍｉｎ，在 超 净台里均匀倒入无菌９ｃｍ 培养皿内，厚度约４ｍｍ， 冷却凝固后，存放于４ ℃冰箱，备用。产淀粉酶细 菌筛选培养基：在 ＮＡ 培养基 的 基 础 上 加 入１ｇ淀 粉作为筛选 底 物，另 加０．００５％的 台盼 蓝 作 为 指 示 剂，１２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ，在超净台里均匀倒入 无菌９ｃｍ 培 养皿 内，厚 度 约４ ｍｍ，冷 却凝 固 后， 存放于４ ℃冰 箱，备 用。产纤维素酶细菌筛选培养 基：称取羧甲基纤维素钠５．０ｇ，硫酸铵２．０ｇ，磷酸二 氢钠１．０ｇ，七水合硫酸镁０．５ｇ，氯化钠０．５ｇ，硝酸 钾１．０ｇ，蛋白胨０．５ｇ，酵母膏０．５ｇ，０．００５％刚 果红作 为 指 示 剂，ｄｄＨ２Ｏ 定 容至１０００ ｍＬ，调 节 ｐＨ 值为７．０，１２１ ℃高压灭菌３０ｍｉｎ，在超净台里 均匀倒入无菌９ｃｍ 培养皿内，厚度约４ｍｍ，冷却 凝固后，存放于４ ℃冰箱，备用。产蛋白酶细菌筛 选培养基：称取酪蛋白１０ｇ，琼脂１０ｇ，加ｄｄＨ２Ｏ 定容至５００ｍＬ，用 ＮａＯＨ 调节ｐＨ 值为７．０～７．５， １２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ，在超净台里均匀倒入无菌 ９ｃｍ 培养皿内，厚度约４ｍｍ，冷却凝 固 后，存 放 于４ ℃冰箱，备用。产脂肪酶细菌筛选培养基：在 ＮＡ 培养基中加入１２％橄榄油乳化液、０．００５％溴甲 酚紫，调节ｐＨ 值为８．０，１２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ， 在超净台里均匀倒入无菌９ｃｍ 培 养皿 内，厚 度 约 ４ｍｍ，冷却凝固后，存放于４℃冰箱，备用。橄榄 油乳化液的配制：橄榄油和０．０２ｇ／ｍＬ的聚乙烯醇 （ＰＶＡ）以体积比１∶３的比例混合，６０ Ｈｚ震荡混 匀５～１０ｍｉｎ，得乳化液。

１．２．２ 样品制备

取 ３ 头小菌虫成虫分别置于 ２ｍＬ试 管 中，饥 饿 ２４ｈ 后，移于无菌离心管 内， 进行体表消毒，首先 以７５％酒 精浸 泡５ｍｉｎ，重 复 ２次后，再以无 菌 水 漂 洗３次，去 除 表 面 细 菌。在 无菌的环境下，用研磨棒充分研磨虫体，得到肠道 细菌原液。设３组重复，分别进行涂板。

１．２．３ 小菌虫肠道细菌的分离

取上述研磨液，分 别稀释为１０－１、１０－３和１０－５浓度，各取１００μＬ 在 牛肉膏蛋白胨培养基上涂布均匀，放于培养箱３７℃ 培养２４ｈ。待 菌 生 长 后，通 过 菌 落 的 形 态 大 小 对细菌进行分离纯化，分离纯化得到单个菌株，去除 重复菌株，保存备用。

２ 结 果

通过传统分离培 养法，从小菌 虫 肠 道 内 分 离 出 ４ 种 主 要 肠 道 细 菌， 编号 Ｘｊｃ１、Ｘｊｃ２、Ｘｊｃ３和 Ｘｊｃ４。经 细菌１６ＳｒＤＮＡ 序列 ＰＣＲ 扩 增，电 泳 均 出 现 约 １５００ｂｐ 的 条 带 ，测 序 结 果 进 行 ＢＬＡＳＴ 比 对，并对 其 同 源 序列用 ＭＥＧＡ５．０软 件以 Ｎ－Ｊ法 构建 系 统 发 育 树。 结果表明 Ｘｊｃ１和 枯 草 芽 胞 杆 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ） 的同源性为９９．３０％，且分类在同一支上支持率为 ９９％；Ｘｊｃ２和肺炎克雷伯菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉ－ ａｅ）的同源 性 为９８．２３％，且 分类 在 同 一 支 上 支 持 率为９９％；Ｘｊｃ３和 Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ 同源 性为９９．０９％，且分类在同一支上支持 率 为 ９０％； Ｘｊｃ４和高地芽胞杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）的 同 源性为 ９８．１３％ 。表 明 Ｘｊｃ１ 为 枯 草 芽 胞 杆 菌，Ｘｊｃ２ 为 克 雷 伯 菌 属 细 菌，Ｘｊｃ３ 为 Ｐｓｅｕｄｏｃ－ ｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ，Ｘｊｃ４为芽胞杆菌属细菌。

３ 讨 论

在小菌虫肠道中分离到４种可 培养细 菌，分 别 是 枯 草 芽 胞 杆 菌、肺 炎 克 雷 伯 菌、 Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ和芽胞杆菌。其中，２种 芽胞杆菌属细菌有产消化酶活性。枯草芽胞杆菌有 产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶活性，芽胞杆菌仅有 产蛋白酶活性，但产酶能力低于枯草芽胞杆菌。昆虫肠道细菌受外界环 境因素的影响，不同地域的同种昆虫其肠道细菌的 组成结构是存在差异的，且取食是肠道微生物变化 的主要影响因素［８－９］。本研究仅在小菌虫的肠道中分 离出４种可培养细菌，可能与小菌虫长期饲养于实 验室内有关，实验室饲养环境稳定，食料单一，是 导致小菌虫的肠道细菌组成结构相对简单的主要原 因。另外，小菌虫一直在粮食、饲料或其他腐败物 中孳生，肠道中可能存在大量不可培养的厌氧细菌。 有研究表明，同为贮藏害虫的黑粉虫 （Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂ－ ｓｃｕｒｕｓ）肠道中仅存在金杆菌属 （Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、 李斯特 菌 属 （Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、微 杆菌 属 （Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉ－ ｕｍ）、莫拉菌属 （Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）和短小杆菌属 （Ｃｕｒ－ ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等５个属可培养细菌［１０］；同样，黄粉 虫 （Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ） 肠 道 细 菌 的 结 构 也 比 较 简 单，可分离到放线菌属 （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、丙酸杆菌属 （Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、柠檬酸杆菌属 （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、 沙雷菌属 （Ｓｅｒｒａｔｉａ）、芽胞杆菌属 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、皮杆菌 属 （Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ）、短状杆菌属 （Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、 棍状杆 菌 属 （Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）和 微小 杆 菌 属 （Ｅｘｉｇ－ ｕｏｂｃａｃｔｅｒｉｕｍ）等９个 属可 培 养 细 菌［１１］。推 测贮 藏 害虫的肠道可培养细菌的组成均比较单一，可能与 其迁移能力弱、食物单一有关。



 

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