细胞增殖和凋亡的影响及其机制(博迅细胞培养箱

微小 ＲＮＡｓ （ｍｉＲＮＡｓ）是一 类 由 １８～２５ｎｔ 组成的非编码 ＲＮＡ，可通过直接与靶基因的３′端 非翻译区 （３′－ＵＴＲ）相互作用调控靶基因的表达， 参与细胞的增殖、分化和凋亡等生物过程，与包括 食管癌在内的多种疾病的发生发展有密切关联。 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ被证实在食管癌组织中表达下调，不 仅可通过靶 向 ＥＲＢＢ４、Ｉｒｆ２和 ＣＸＣＲ 参与 调 控 食 管癌的炎症反应，还可通过靶向 ＥＲＢＢ４诱导癌细 胞凋亡和抑制细胞增殖；然而其 调 控 食 管 癌 细 胞增殖和凋亡的分子机制尚未见报道。上皮细胞转 化序 列 ２ （ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ２，ＥＣＴ２）基因被证实是一种重要的致癌基因，在 乳腺癌和肺腺癌等细胞增殖和凋亡过程中发挥重要作用。

１ 材料与方法 

１．１ 细胞、主 要 试 剂 和 仪 器

 人 食 管 癌 ＥＣ－１０９ 细 胞和人正常食管上皮 ＨＥＴ－１Ａ 细 胞 （美 国 ＡＴＣＣ公司）。胎牛血清 （兰州民海生物工程有限 公司），ＲＰＭＩ－１６４０ 培 养 基 （美 国 Ｇｉｂｃｏ 公 司）， 胰 蛋 白 酶、 二 甲 基 亚 枫、 噻 唑 蓝 （ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ＭＴＴ） 试 剂 （美 国 Ｓｉｇｍａ 公 司 ），ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及其 阴 性 对 照 片 段 （江 苏 百 奥 迈 科 生 物 技 术 公 司）， 青 链 霉 双 抗 混 合 液 （美 国 Ｇｅｍｉｎｉ公司），细 胞 周 期 蛋 白 Ｄ１ （ＣｙｃｌｉｎＤ１）抗 体、细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 ２ （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１，ＣＤＫ２） 抗 体、ＥＣＴ２ 抗 体、Ｂｃｌ－２ 相 关 Ｘ 蛋 白 （Ｂｃｌ－２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂａｘ）抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨 酸 蛋 白 水 解 酶 ３ （Ｃｌｅａｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３，Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３） 抗 体、 β肌动 蛋 白 （β－ａｃｔｉｎ） 抗 体 （武 汉 博 士 德 生 物 公司 ）， 硝 酸 纤 维 素 膜 （ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＣ）（美国 Ｐｉｅｒｃｅ公司），辣根过氧化 酶标记的二抗 （北京中杉金桥生物有限公司），报 告基因表达 载 体 （美 国 Ａｍｂｉｏｎ公司），二喹 啉 甲 酸 （ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ，ＢＣＡ）蛋白 浓 度 测 定 试 剂 盒、电 化 学 发 生 （ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， ＥＣＬ）试 剂 盒 （上 海 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ）， ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００、实时荧光定量 ＰＣＲ试剂盒、 ｃＤＮＡ 合 成 试 剂 盒 （美 国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ）， ＴＲＩｚｏｌ总 ＲＮＡ 抽提 试 剂 盒 （北京百泰克生物公 司），双荧 光 素 酶 检 测 试 剂 盒 （美 国 Ｐｒｏｍｅｇａ公 司），细胞凋亡检测试剂盒 （美国 ＢＤ 公司）。流式 细胞仪 （美 国 ＢＤ 公司），ＰＣＲ 扩增 仪 （美 国 ＭＪ 公司），ＵＶＰ 凝胶图象分析仪 （英国 ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ 公司），ＣＯ２ 细胞培养箱 （上海博迅医疗仪器有限 公司）。 

１．２ 细胞培养

 采用含有１０％胎牛血清和双抗的 ＲＰＭＩ－１６４０培养基于体积分数为５％ＣＯ２、温度为 ３７℃、饱 和 湿度细胞培养箱中培养 ＥＣ－１０９ 和 ＨＥＴ－１Ａ 细胞。每隔２ｄ更换新鲜培养液。待细胞 铺满瓶底 时，以０．２５％胰蛋 白 酶 消 化 传 代。收 集 生长良好的对数生长期细胞进行实验。 

１．３ 细胞 分 组 和 转 染 

将 ＥＣ－１０９细胞 分 为 空 白 对照组 （未转染）、ｍｉＲ－ＮＣ组 （转染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ阴 性 对 照）、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 组 （转 染 ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ）、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 组 （转 染 ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ阴 性 对 照） 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 组 （转染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），每组 设 ３ 个 复 孔。将 ＥＣ－１０９细胞以每孔５００μＬ （约３×１０６ 个） 接种至６孔细胞板上，培养箱内培养过夜。待细胞 贴壁生长 约 为７５％融合 时，参 照 ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００说明书步骤将配制的脂质体 ｍｉＲＮＡ 混合物按 照实验分组加入到 ＥＣ－１０９细胞中。转染６ｈ后更 换含胎牛 血 清 的 新 鲜 培 养 基。继 续 培 养 ４８ｈ 后， 收集各组细胞进行后续实验。 

１．４ 实时荧光定量

 ＰＣＲ 法检测 ＨＥＴ－１Ａ 细胞和 ＥＣ－１０９细胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表达 水 平 收 集 未 转 染的 ＨＥＴ－１Ａ 细胞、ＥＣ－１０９细胞和转染４８ｈ的各 组 ＥＣ－１０９细胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ法提 取 总 ＲＮＡ，采 用分 光 光 度 计 测 定 ＲＮＡ 的浓度和完整性。参照 ｃＤＮＡ 合成试剂 盒 说 明 书 步 骤 反 转 录 合 成ｃＤＮＡ。 以ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ扩增。２０μＬ反应体系： ２μＬｃＤＮＡ， 加 入 １０μＬ２× 定 量 ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、各 ０．０８ μＬ 上 下 游 引 物 （摩 尔 浓 度 为２０μｍｏｌ·Ｌ－１）、０．４ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （２．５Ｕ·μＬ－１）和 ６μＬｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ 反 应 体 系： ９５ ℃ 预 变 性 ３ ｍｉｎ，９５ ℃ 变 性３０ｓ、６０ ℃ 复 性 ３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共４０个循环。ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 引物：Ｆ５′－ＡＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＴＧ－３′，Ｒ５′－ ＴＧＣＴＴＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ－３′； Ｕ６ 引 物： Ｆ５′－ＡＴＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴ－３′， Ｒ５′－ＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧ－３′。 以 Ｕ６ 为内参，采 用 ２－△△Ｃｔ法 计 算 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 的 相 对 表达水平。实验重复３次。 １．５ ＭＴＴ 法 检 测 各 组 ＥＣ－１０９ 细 胞 活 性 以 １０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 ５ ｍｉｎ 后收 集 各 组 ＥＣ－１０９ 细 胞，调整细胞浓度为２×１０４ ｍＬ－１。以每孔１００μＬ 平铺于９６孔细胞板上，每组设３个平行孔。置于 细胞 培 养 箱 内 常 规 培 养，分 别 在 培 养 ２４、４８ 和 ７２ｈ后向每孔中加入１０μＬ ＭＴＴ （５ｇ·Ｌ－１）溶 液孵育４ｈ，并以１００μＬ二甲基亚砜溶解 ＭＴＴ 结 晶。采用酶标仪在４５０ｎｍ 波长处检测各组细胞的 吸光度 （Ａ）值，重复测量３次，取 Ａ 值平均值表 示各组细胞活性。

２ 结 果

食管癌 ＥＣ－１０９细胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表达水平 （１．００±０．０６）明显低于正常食管癌上皮 ＨＥＴ－１Ａ 细胞 （０．２６±０．２８） （ｔ＝４．４７６，Ｐ＝０．０１１）。与 空白 对 照 组 比 较，ｍｉＲ－ＮＣ 组 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 组 ＥＣ－１０９细胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表达水平差异无统 计学意义 （Ｐ＞０．０５）；ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ组 ＥＣ－１０９细 胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表达水平较 ｍｉＲ－ＮＣ组明显升 高 （Ｐ＜０．０５），ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ组 ＥＣ－１０９细胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表达水平较ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ组明显降 低 （Ｐ＜０．０５）。见

３ 讨 论

 肿瘤发生发展过程中往往伴随着某些 ｍｉＲＮＡｓ 的异 常 表 达，而 这 些 ｍｉＲＮＡｓ在 肿 瘤 细 胞 增 殖、 侵袭、转移和凋亡过程中发挥重要作用；其中， 作为 ｍｉＲ－３０２ 基 因 簇 家 族 中 的 重 要 代 表，ｍｉＲ－ ３０２ｂ在多种肿瘤的进程中扮演着重要角色。ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐ在胃癌组织和细胞中表达水平下调，上调 其 表 达 可 通 过 靶 向 胰 岛 素 样 生 长 因 子 １ 受 体 （ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＧＦ－１Ｒ）抑制 ＡＫＴ 信 号 通 路 的 激 活，影响周期相关蛋白 ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６ 和 凋 亡 蛋 白 Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２的表 达 发 挥 抑 制 细 胞 增 殖、细 胞 周 期 Ｇ１→Ｓ转化并诱导细胞凋亡的作用。同时，ｍｉＲ－ ３０２ｂ 还 可 通 过 靶 向 调 控 ＥｐｈＡ２ 减 弱 Ｗｎｔ／ β－ｃａｔｅｎｉｎ／ＥＭＴ 信号 级 联 通 路 抑 制 胃 癌 细 胞 的 增 殖、侵 袭 和 迁 移。在 恶 性 胸 膜 间 皮 瘤 细 胞 中， ｍｉＲ－３０２ｂ通过靶向 Ｍｃｌ－１抑制肿瘤细胞的增殖并 诱导细 胞 凋 亡。肝 癌 组 织 中 ｍｉＲ－３０２ｂ 表 达 降 低，ｍｉＲ－３０２ｂ过表 达 可 通 过 直 接 靶 向 Ａｋｔ２ 减弱 ＮＦ－κＢ和 ＭＭＰ－２ 的 表 达 抑 制 癌 细 胞 的 侵 袭 和 转 移。此外，ｍｉＲ－３０２ｂ还可 通 过 靶 向 调 控 Ｅ２Ｆ１ 增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性，降 低 细 胞 活 性。可见，ｍｉＲ－３０２ｂ可通过调控多种靶基因或 途径调控肿瘤的发生发展。

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