荧光定量PCR检测方法的建立(博迅摇床使用)

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）通常称大肠杆菌，在 一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿 道等多种局部组织器官感染，是人体内较为常见的食源性 致病菌。近年来，因大肠杆菌污染水或食物造成人类食物 中毒的例子日益增多，该污染物给饮用水水质带来了极大 的安全隐患。中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质 卫生规范》规定，总大肠菌群及粪大肠菌群每 100mL 水样 中不得检出。因此，实现水质大肠杆菌的快速检测显得尤 为重要。

1 材料与方法 

1.1 材料 

1.1.1 实验材料

 大肠杆菌 E. coli BL21、E. coli TG1 均由本实验室保 存并提供。 

1.1.2 试剂

 pTA2 载体购自上海捷瑞生物公司，基因组提取试剂 盒、割胶回收试剂盒、质粒 DNA 小量提取试剂盒等均为上 海庄盟生物科技有限公司的产品。NaCl 为无锡市东昌化学 试剂有限公司产品，琼脂粉、琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物 等化学试剂均购于上海泽衡生物技术有限公司。10×PCR buffer，MgSO（4 50mmol/L），dNTPS（2.0mmol/L），Taq 酶，50% DMSO，2×SYBR premix Ex-Taq 等均购于 TOYOBO 公司。 uida 基因片段相关引物均由上海生工生物技术有限公司 合成。 

1.1.3 仪器

 台式高速冷冻离心机（德国西格玛有限公司，Sigma 3K-15）；水平电泳系统（北京市六一仪器厂，DYCP-31D）；恒温培养箱（太仓精宏仪器设备有限公司，JINGHONG）；恒 温摇床（上海博迅实业有限公司，DSHZ-300A）；电泳成像 系统（上海天能科技有限公司，Tanon-2500）；超净台（苏州 净化设备有限公司，SW-CJ-IF）；水浴锅（太仓精宏仪器有 限公司，JINGHONG）；荧光定量 PCR 仪（德国耶拿分析仪 器股份公司，MiniOpticon）；紫外-可见分光光度计（上海沪 粤明科学仪器有限公司，TU-1900）；图像分析系统（Tanon， Image master VDS）。 

1.2 方法 

1.2.1 大肠杆菌 E.coli BL21 菌基因组提取

 BL21 菌液培养至测到菌液吸光值为 OD=0.2-0.6 时， 根据上海庄盟生物科技有限公司基因组提取试剂盒说明 书对 BL21 菌进行总 DNA 的提取。质粒 DNA 提取方法参 考小量质粒抽提试剂盒内说明书。提取后的质粒 DNA 用 紫外分光光度计测定其 OD260/OD280 的数值。 

1.2.2 PCR 扩增大肠杆菌 uida 保守基因片段

 通过 GenBank 查找 uida 基因序列，通过 BLAST 比对 筛选出更为保守的基因片段约为 800bp，设计两对 PCR 引 物（如表 1 所示），采用表 1 中的 uida-F/uida-R 引物，以大 肠杆菌基因组为模板，对大肠杆菌 uida 保守基因片段进行 常规 PCR 反应。反应体系共计 50μL，ddH2O 37.5μL，基因 组模板 1μL，10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，Taq 酶 （5U/μL） 0.5μL，上下游引物各 1μL。扩增反应程序如下： 94℃预变性 3min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，30 个循 环进行延伸；4℃保温 10min。反应结束后，取 5μLPCR 产物 进行 1%琼脂糖凝胶电泳，再由割胶回收试剂盒割胶回收， -20℃保存。

1.2.3 标准品重组质粒构建

 将上述克隆的 uida 基因片段通过 TA 克隆方法与 pTA2 载体连接，反应体系如下：目的基因 7μL，pTA2 载体 1μL，T4 连接酶 1μL，T4 连接酶 buffer 1μL。16℃水浴连接 16h 后，将 uida 重组质粒转化至 TG1 菌感受态细胞中，均 匀涂布到含氨苄的 LB 平板中，37℃培养 12-16h。挑取单菌 落培养过液后进行测序。抽提质粒进行 1%琼脂糖凝胶电 泳鉴定，所获得的重组质粒命名为 pTA2-uida。 

1.2.4 荧光定量 PCR 条件优化

荧光定量 PCR 引物采用表 1 中的 quida-F1/quida-R1 的引物，通过优化荧光定量 PCR 反应体中退火温度，退火 温度选择在 55~65℃范围内，以 1℃作为梯度进行优化。最 佳条件根据扩增曲线的 Ct 值和熔解曲线来判断。

2 结果与分析

选取 5 个梯度（103 ~107 copies/μL）的标准重组质粒，进 行荧光定量 PCR 检测，曲线呈现 S 型，表明 Ct 值与浓度存在良好的线性关系。由此，以模板浓度对数 值为纵坐标，Ct 值为横坐标建立荧光定量 PCR 检测 E.coli 的标准曲线。曲线回归的标准方程为：Y=- 0.3823X+12.172（直线斜率 A=-0.3823，截距 B=12.172，X= 模板浓度，单位为 copies/μL），且曲线的相关系数 R2 >0.98， 说明可信度较高。重复性测定 107 copies/μL、105 copies/μL、 103 copies/μL 高中低三个梯度质粒模板 Ct 值，计算平均值和变异系数。 可知，随浓度降低，扩增曲线的标准差逐渐 增大，变异系数则始终小于 1%，则说明在合 理的误差范围内，建立的水质荧光定量 PCR 方法重复性好。

3 讨论 

大肠杆菌作为粪源性污染卫生细菌学 指标，在环境水质监测中起着非常重要的指 示作用。若水体中检测出大肠杆菌则意味着 水质已被污染。分布在自然界的大肠杆菌 大多数是不致病的，主要附生在人或动物的 肠道里，为正常菌群，但少数的大肠杆菌具 有毒性，侵入人体时，可引起感染，如腹膜 炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。对老人及小 孩的感染可能是致命性的。因此，我国在饮 用水方面的卫生标准限定 100ml 水样中不 得检测出大肠杆菌，该标准要求必须达到检 出单个细菌的水平。

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