冷藏草鱼源气单胞菌对生物膜形成的影响(SWCJ-2

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肉质鲜嫩、营养丰 富，深受消费者的喜爱，是我国淡水养殖产量最高的鱼 类，2017年产量高达534.56万 t。水产品在贮藏、运输 以及销售过程中，常常由于几种微生物的活动而导致腐 败变质，这些微生物被称为特定腐败菌，是引起水产品 腐败的关键因素。已有研究显示气单胞菌是冷藏草鱼 的特定腐败菌，草鱼在4 ℃贮藏8 d时，气单胞菌数量达 到8.49（lg（CFU/g）），占细菌比例的48.76%。气单 胞菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，最低生长温度为 0～5 ℃，可以在低温条件下与其他嗜冷菌竞争，因此在 冷藏水产品中常常检出，鱼类水产品中气单胞菌的污染 率达31.9%。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胰蛋白胨大豆肉汤（trypticase soy broth，TSB）、 Luria-Bertani（LB）肉汤、LB琼脂、生理生化实验试剂盒青岛海博生物技术有限公司；结晶紫、乙醇 国药 集团化学试剂有限公司； N - 丁酰基高丝氨酸内酯 （N-butanoyl-L-homoserinelactone，C4-HSL）、N-己酰 基高丝氨酸内酯（N-hexanoyl-L-homoserinelactone，C6- HSL） 上海甄准生物科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、2×EasyTaq PCR Supermix 全式金生物 技术有限公司；RP-18 F254S反相C18-薄层色谱板 德国 Merck公司。

1.2 仪器与设备

SHP-250生化培养箱 上海培因实验仪器有限公司； HY-60振荡摇床 武汉汇诚生物科技有限公司；LDZX40II型高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械公司；SWCJ-2FD 超净工作台 上海博迅实业有限公司；UV-1300 型紫外-可见分光光度计 上海美析仪器有限公司； Tanon-5200凝胶成像系统 上海天能科技有限公司； KH19A高速离心机 湖南凯达科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离

冷藏草鱼贮藏8 d（货架期终点），随机取出2 尾， 无菌条件下取腹部鱼肉25 g，参照Wang Guangyu等的 方法分离气单胞菌。挑取菌落数在30～300 CFU的平板， 对单菌落进行纯化并保存。纯化的菌株以W1、W2、 W3……进行命名。

1.3.2 细菌的鉴定

利用全式金细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA， 然后扩增细菌的16S rRNA序列，将聚合酶链式反应 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往生工生物工程 （上海）股份有限公司测序。测序结果利用NCBI数据库 进行比对。 将分离的气单胞菌属细菌进行氧化酶、氨基酸、糖 类利用、七叶苷等生理生化实验，在细菌种水平上进一 步鉴定。

1.3.3 AHLs活性检测

平板划线法：将待检测菌株与报告菌株CV026在LB平 板上平行划线，28 ℃培养18～24 h，观察颜色变化。 报告平板法：利用报告平板法检测细菌生长过程中 的AHLs活性变化。过夜活化的菌株W41和W69接种于 LB肉汤，每隔4 h取10 mL菌液，12 000 r/min离心10 min 后，获得细菌上清液，将细菌上清液经0.22 μm微膜过滤除菌后，于－20 ℃保存备用。取过夜培养至对数期的紫 色杆菌CV026 2～3 mL，加入冷却至40 ℃的含1.5%琼脂 的LB中，混匀后倾倒平板。待平板凝固后，用无菌打孔 器在琼脂中央打孔，加入50 μL不同培养时间的细菌上 清，于28 ℃培养24～48 h，用游标卡尺量取紫色区域直 径，直径越大表明AHLs浓度越高。

2 结果与分析

利用分子生物学方法，对20 株细菌进行16S rRNA扩 增，获得的序列经NCBI数据库进行BLAST比对，结果 显示均为气单胞菌属（Aeromonas）。生理生化实验结果 （表1）显示，本研究分离的气单胞菌氧化酶反应均为阳 性，均不能利用鸟氨酸和阿拉伯糖，而均具有利用葡萄 糖产酸的能力，但是相同种水平的细菌在精氨酸、赖氨 酸、七叶苷、水杨苷等的利用上存在差异。Abbott等的 研究也显示气单胞菌属在种水平的鉴定比较困难，传统 的生理生化反应多有重叠，很难明确区分，而且鉴定的 实验方法也不一致。结合16S rRNA结果，本研究分离的 气单胞菌属包括杀鲑气单胞菌（A. salmonicida，7 株）、 嗜水气单胞菌（A. hydrophila，5 株）、中间气单胞菌 （A. media，3 株）、A. rivuli（3 株）和A. molluscorum （2 株），其中嗜水气单胞菌包含多个亚种。

利用结晶紫染色法半定量检测气单胞菌的生物膜 形成情况，因为葡萄糖促进细菌生物膜的形成，所以在 初步检测细菌的生物膜形成能力时，采用含有葡萄糖的 TSB肉汤进行培养。参考Stepanovic等的方法，将空 白孔A590 nm值的3 倍标准差作为临界cut-off值，根据A590 nm 值将细菌分为以下几类：A590 nm≤0.20，弱生物膜形成能 力；0.20＜A590 nm≤0.80，中等生物膜形成能力；A590 nm＞ 0.80，强生物膜形成能力。

3 结 论 

检测了冷藏草鱼源分离获得的20 株气单胞菌 Aeromonas spp.的群体感应现象和生物膜形成情况，有 18 株气单胞菌可以产生AHLs信号分子，20 株菌均显示 有不同强弱程度的生物膜形成能力。以生物膜形成能力 较强的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69为主要对 象，结果表明2 株菌的AHLs活性具有菌体密度依赖性， 该2 株菌主要产生C4-HSL和C6-HSL信号分子，AHLs对 细菌的生物膜形成能力影响不同，其中高浓度C6-HSL 促进A. salmonia W41生物膜的形成；而高浓度AHLs降 低了A. salmonia W69的生物膜形成，低浓度AHLs促进 A. salmonia W69生物膜的形成。本研究显示大多数草鱼 源气单胞菌可以产生群体感应信号分子，并且AHLs可以 影响气单胞菌生物膜的形成情况，为水产品保鲜剂的开 发提供一定的理论支持。



 

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