再生障碍性贫血患者骨髓MSC增殖分析

再生障碍性贫血（AA）的发病机理十分复杂， 目前认为其发病主要与造血干细胞（HSC）量与 质的改变、骨髓造血微环境缺陷和免疫功能紊乱 有关。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一种位于骨髓中具有自我更新、分化增殖 和多向分化潜能的干细胞。MSC 是骨髓造血微环境的重要组成部分，在造血调控中具有重要作用。

材料和方法 

病例资料 本院 2016 年 7 月 - 2017 年 2 月确诊再生障碍性 贫血患者 10 例；其中 4 例男性和 6 例女性，年龄 25±10 岁；同时招募 5 名健康供者，其中 4 名男 性和 1 名女性，年龄 31±15 岁作为对照，本研究 得到本院伦理委员会的批准，所有受试者均签署 知情同意书。 试剂与仪器 骨髓间充质干细胞来源于本医院知情同意的再 生障碍性贫血患者及健康供者；High DMEM 基 础培养液购自中国 Hyclone 公司；FBS 购自美国 Gibco 公司；DAPT 购自日本 Sigma 公司；CCK8 试剂盒为中国碧云天公司产品；AnnexinV-FITC/ PI 试剂盒为中国南京凯基生物公司产品；细胞 周期检测试剂盒为中国北京嘉美生物公司产品； PMSF 为美国 Amresco 公司产品；VEGF antibody 为美国 Affinity 公司产品；β-actin antibody 为英 国 Abcam 公司产品；油红 O 为中国生工生物公 司产品；TRIZOL、RNA 溶解液均为中国全式金 公司产品；氯仿、异丙醇均为中国国药集团化学 试剂有限公司产品；DEPC 为美国 Amresco 公司 产品；FITC 购自中国 Keygen 公司产品。低速离 心机购自中国上海贝恩生物科技有限公司；CO2 培养箱购自中国上海博讯公司；倒置显微镜为 日本 Olympus 公司产品；酶标仪为美国 Thermo Scientific 公司产品；流式细胞仪为美国 Becton Dickinson 公司产品；超凝胶成像仪为美国 BioRad 公司产品。 骨髓间充质干细胞（MSC）的分离及鉴定 从 AA 患者收集骨髓（BM）标本（5 ml），并从 健康供者收集正常 BM 标本。从 AA 患者的 BM 分 离 MSC。将 5 ml 骨髓与 DMEM（1︰1） 混 合 的 BM 样品添加到淋巴细胞分离培养液（1.077 g/ml） 上，并通过离心机分离。将骨髓单核细胞重悬于DMEM 培养液中，并以 1×105 /ml 的密度接种于培 养瓶中。在 37 ℃、5％ CO2、饱和温度的培养箱中 培养 48 h 后更换培养液。培养 3-4 d 后，细胞生 长至 80%-90% 融合，消化，传代，依次记为第 2、 第 3…代细胞。取第 3 代细胞进行流式细胞术检测。 待融合达 80%-90% 时，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化 2-4 min，待 90% 左右细胞悬浮后用血清终止消化， 应用吸管仔细吹打使之形成细胞悬液。细胞悬液 经 100 目的滤筛过滤。离心后弃上清，用 PBS 制 成 2×105/ml 的细胞悬液，将细胞悬液分装至 4 支 样品管中。在 4 支样品管中分别加入：FITC antihuman CD34、FITC anti-human CD44、FITC antihuman CD45、FITC anti-human CD90；混匀，4 ℃ 下避光反应过夜。弃上清，每管再加入 PBS 0.5ml 重新混悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD34、CD90、CD44、CD45 的表达。 实验分组 实验分为 5 组：①正常 MSC 组：正常人的 MSC 于 DMEM 完全培养液中培养；② AA 组：AA 患者的 MSC 于 DMEM 完全培养液中培养；③ DAPT 组： AA 患者的 MSC 于含有 10 μmol/ LDAPT 的 DMEM 完全培养液中培养；④ VEGF 组：AA 患者的 MSC 于含有 100 ng/ml VEGF 的 DMEM 完全培养液中培 养；⑤ DAPT+VEGF 组：AA 患者的 MSC 于含 10 μmol/LDAPT 和 100 ng/ml VEGF 的 DMEM 完全培 养液中培养。 CCK8 检测细胞增殖活性 通过细胞计数试剂盒 8 检测不同组中 MSC 的增 殖能力。将 MSC 接种在 96 孔板（每孔 100μl） 中并在 37 ℃下用 5％ CO2 培养直至完全粘附。用 DAPT 或 / 和 VEGF 处理 48 h 后，向每个孔中加入 10μl CCK8 溶液并孵育 2 h。通过酶标仪检测 450 nm 处的光密度（OD）。 细胞凋亡和细胞周期检测 采用流式细胞术检测不同组 MSC 的凋亡和细胞周 期。用 DAPT 或 / 和 VEGF 处理 48 h 后，用 0.25％ 胰蛋白酶消化 MSC。通过以 250 ×g 离心收集细 胞，并用冷磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤 2 次。然 后将这些细胞重悬于 300 μl 结合缓冲液中，并与 5 μl 膜联蛋白 V- 荧光素异硫氰酸酯（FITC）在 室温下黑暗中孵育 15 min。随后在室温下与 10 μl 碘化丙啶（PI）在黑暗中孵育 10 min，在流式细胞 仪上分析细胞凋亡。在检测细胞周期中，将消化的 MSC 用 5 ml 70％冷乙醇在 4 ℃下固定过夜。用 冷 PBS 洗涤 2 次后，将这些细胞与 0.5 ml PI 在黑 暗中孵育 20 min，最后在流式细胞仪上分析细胞 在细胞周期中的分布。

结　　果 

AA患者和健康供者 MSC的分离培养 图1为 AA 患者骨髓 MSC 分离后 d 1 及分离培养 后 d 7 的图像。图 2 为骨髓间充质干细胞免疫表型细胞比例流式图。由图可见，正常组和 AA 组 MSC 细胞 CD34 和 CD45 均低表达。CD44 和 CD90 均高 表达，AA 组 CD44 和 CD90 表达略高于正常组，但 无显著性差异（P ＞ 0.05）。2 者细胞群体基本一致。 细胞增殖活性 CCK8 检测结果显示，与正常 MSC 组相比，AA 组 细胞OD值降低，说明细胞增殖降低。与AA组相比， 经过DAPT处理后，细胞OD值降低，细胞增殖降低； 经过 VEGF 处理后，细胞 OD 值增加，细胞增殖增 加；经过 DAPT 和 VEGF 联合处理后，细胞增殖 高于 DAPT 单独处理组，但低于 VEGF 处理组（图 3）。结果提示，AA 患者细胞增殖弱于正常对照者细胞，VEGF 能改善 AA 引起的细胞增殖降低现 象。Notch 信号通路的抑制会加剧 AA 患者 MSC 的 增殖抑制。

讨　　　论 

再生障碍性贫血（AA）是一种临床常见的血液系 统疾病，其临床表现为全血细胞减少，继发贫血、 出血、感染而危及患者生命 。造血干细胞（HSC） 移植和抗胸腺细胞球蛋白联合环孢菌素 A 和雄激 素是 AA 的主要治疗策略 [2,3] 。目前研究表明，骨 髓间充质干细胞（MSC）作为骨髓基质细胞的前体 细胞 , 是一类具有自我更新能力和具有免疫调节作 用的干细胞 , 是骨髓造血微环境的重要组成部分 , 其通过介导造血干细胞黏附 , 分泌多种细胞因子和 生长因子而发挥造血支持作用。据报道，MSC 在再生障碍性贫血细胞增殖，分化和造血方面具 有重要作用 , 并发现 CD106 在 MSC 通 过 NF-κB 在 AA 中发挥重要作用。MSC 可以通过调节几乎 所有免疫细胞的功能来支持造血功能并维持免疫 稳态 。同时，AA 患者 MSC 表现出异常的基因表 达谱和异常的免疫学特性，表明 AA 患者的 MSC 功能异常 。然而，仍需要研究 MSC 对 AA 的分 子机制。

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