原位酯交换制备酵母菌生物柴油（BXM-30R使用）

0 前言 

生物柴油是以油料物质( 大豆、油菜籽、动物油 脂、餐饮废弃油脂) 或产油酵母菌、微藻等为原料， 与甲醇或乙醇通过酯化或酯交换反应制得的可替代 石化柴油的绿色清洁燃料，其具有无毒、可降解、含 硫量少、可再生性等优势，是绿色新能源发展的重要 研究目标。酵母菌、微藻等微生物由于生长速度 快，体内油脂含量高，且不占用土地、粮食等资源，被 认为是理想的生物柴油生产原料。

1 实验部分

 1． 1 试剂与仪器

 试剂: 正己烷、甲醇，色谱级，上海阿拉丁; 氯化 钠，分析纯，辽宁泉瑞试剂有限公司; 氢氧化钾，分析 纯，国药集团化学试剂有限公司。 仪器: 博迅BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器，上海博 讯实业有限公司; BSD － YX3200 智能精密摇床，上 海博迅实业有限公司; AS3120B 超声波清洗器，天津 奥特赛恩斯仪器有限公司; 7890B 气相色谱仪，美国 Agilent 公司; M7 － 300EI 质谱仪，北京普析通用仪 器有限责任公司; H1650 离心机，湖南湘仪实验室仪 器开发有限公司; N － EVAP111 氮吹仪，美国 Organomation。 

1． 2 菌株及培养条件

 酵母菌 S288c 在 30 ℃，200 r/min 条件下，用液 体 YPD 培养基培养。首先，挑取单菌落到 20 mL YPD 液体培养基中活化培养 12 h，之后转移 1 mL 菌液到 50 mL 液体 YPD 培养基中继续培养 9 h。菌 液经 3 000 r/min 离心 5 min，得到菌体用去离子水 洗一次，然后放到干燥箱内烘干备用。 

1． 3 生物柴油的制备

称取 50 mg 干酵母粉，加 2 mL 正己烷，再加入 800 μL 0． 2 mol /L 的 KOH /CH3OH 溶液，超声 30 min 反应结束后，加入 5% NaCl 溶液 300 μL，涡旋 1 min 混匀，静置 10 min，10 000 r/min 离心 5 min，取 上清液，用氮气吹干，最后 100 μL 正己烷溶解，取上 清液 1 μL 进行 GC － MS 分析。 

1． 4 GC － MS 检测条件 

色谱条件: 色谱柱为安捷伦 HP － 5 毛细管柱 ( 3 0 m × 0 ． 3 2 mm × 0 ． 2 5 μm ) ，进 样 口 温 度 2 6 0 ℃ ，分 流 比1 0 ∶ 1 。程 序 升 温 设 置: 初 始 温 度 150 ℃ ; 以 20 ℃ /min 升温至 214 ℃，保持 5 min; 再 以 1 0 ℃ / min 升 温 至 2 8 0 ℃ ，保 持 5 min ，载 气 ( 99． 999 5% 高纯氦气) 流速 1． 2 mL /min。质谱条 件: 离子源温度 230 ℃，传输线温度 280 ℃，溶剂的 延迟时间 2 min，选择离子扫描模式。

2 结果与讨论

 实验以酵母菌为原料，KOH 为催化剂，甲醇为衍生试剂，通过原位酯交换制备生物柴油，气相色 谱 － 质谱分析其成分主要为棕榈酸甲酯、十六烯酸 甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯。单因 素实验优化超声时间、KOH 用量和甲醇用量。峰面 积和产量是正相关的，峰面积越大，产量越大，没有 换算式，是直接相关的。

2． 1 超声时间的影响

 称取 50 mg 干酵母粉，加入 400 μL 0． 05 mol /L 的 KOH － CH3OH 溶液，考察不同超声时间( 5、10、 20、30、40 min) 对酯交换反应影响，结果如图 1 所 示。可以看出，随着反应时间增加，酯交换效率逐渐 增加，30 min 后得到酯总含量最大，之后酯量有所减 少。这可能是由于时间延长，酯交换反应越来越充 分，但时间过长，超声使反应体系温度升高，随溶剂 挥发造成产物损失。

2． 2 KOH 用量的影响

 实验选用 KOH 为催化剂，称取 50 mg 干酵母 粉，分别加入 0． 01、0． 05、0． 20、0． 60、1． 00 mol /L 的 KOH － CH3OH 溶液 400 μL，超声反应 30 min，KOH 用量对生物柴油产量的影响如图 2 所示。

由图 2 可看出随 KOH 浓度增加，生物柴油产量 逐渐增加，在 0． 2 mol /L 时达到最大。之后，KOH 浓 度再增大，柴油产量呈下降趋势。可推测催化剂 KOH 用量增加可以加快反应速率，增加柴油产量，但 KOH 过量后，其可能与产生的酯发生皂化反应， 使柴油产量下降。

3 结论 

采用原位酯交换法制备酵母菌生物柴油，单因 素优化实验结果显示最佳工艺条件: 50 mg 酵母干 粉，甲醇的用量为 800 μL，KOH 用量为 0． 2 mol /L， 超声时间为 30 min。最佳条件下，平行处理 5 份样 品中各脂肪酸甲酯相对标准偏差 ＜ 11% 。生物柴油 成分 包 括 肉 豆 蔻 酸 甲 酯 ( 5% ) 、十 六 烯 酸 甲 酯 ( 24% ) 、棕榈酸甲酯( 48% ) 、油酸甲酯( 13% ) 、硬脂 酸甲酯( 10% ) 。

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