代谢产物芍药苷的药动学研究

苯甲酰芍药苷是一种单萜苷类化合物，主要分布 在毛茛科植物芍药、牡丹等的根部，具有改善心 肌缺血、抗炎、抗病毒、免疫调节、缓解阿尔茨海 默症、清除过氧亚硝基等多种药理作用 。Cheng 等给大鼠灌胃 110 mg·kg-1 的苯甲酰芍药苷，利用 HPLC 检测血浆样品，无法测得原型药物；周晓雯 等分别给大鼠灌胃和注射苯甲酰芍药苷，发现苯甲 酰芍药苷的生物利用度仅为 1.67%，猜测苯甲酰芍药 苷灌胃给药后会在体内迅速发生代谢转化，导致其 生物利用度低。

1 材料

1.1 动物

Sprague-Dawley 大 鼠 ， 雄 性 ， SPF 级 ， （230±20）g，由安徽医科大学实验动物中心提供，许 可证号：SCXK（皖）2017-001。

1.2 药物及试

苯甲酰芍药苷（由本实验室自制， 纯度≥ 98%）；芍药苷（北京世纪奥科生物技术有限公 司，批号：17031901）；肝素钠注射液（江苏万邦生 化医药股份有限公司，批号：1406109）；羧甲基纤 维素钠（天津市致远化学试剂有限公司，分析纯，批 号：20170801）；胃蛋白酶（上海源叶生物科技有限 公司，批号：Y20M9J56420）；胰蛋白酶[生工生物工 程（上海）股份有限公司，批号：E116BA0104]；氢氧 化钠（烟台市双双化工有限公司，分析纯，批号： 20180201）；磷酸二氢钾（北京千年健中生物科技有 限公司，分析纯，批号：20180112）。乙腈（批号： 18015097）、甲醇（批号：10962907829），色谱纯， 德国默克公司；盐酸（上海博河精细化学品有限公司，分析纯，批号：20171006）；甲酸（上海阿拉丁 生 化 科 技 股 份 有 限 公 司 ， 色 谱 纯 ， 批 号 ： A1627009）；磷酸（天津市光复精细化工研究所，色 谱级，批号：20170101）。

1.3 仪器

UItiMate 3000 超高效液相色谱系统（LPG3400RS 四 元 泵 ， VWD- 3400RS 检 测 器 ， TCC3x00RS 柱温箱，Chromeleon 7 色谱工作站，美国赛 默飞世尔科技公司）；ACQUITY H-CLASS UPLC 超高 效液相色谱系统，Xevo G2 Q-TOF 高分辨质谱仪（美 国 Waters 公司）；H1750R 高速冷冻离心机（湖南湘仪 实验仪器开发有限公司）；MTN-2800N 型氮吹浓缩 装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；MixMax 涡旋 振荡器（合肥艾本森科学仪器有限公司）；JK-250DB 型数控超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公 司）；OHAUS EXPLORER 准微量天平（美国奥豪斯公 司）；BSD-TX318 台式恒温振荡器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

2 方法及结果

2.1 苯甲酰芍药苷体外代谢转化研究

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流动 相： 0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 ~1 min，8%~15% B；1~8 min，15%~18% B；8~10 min，18% ~30% B；10~15 min，30% ~35% B；15~ 20 min，35%~85% B；20~21 min，85%~8% B）；流 速：0.2 mL·min-1 ；进样体积：2 μL；柱温：30 ℃。

2.1.2 质谱条件

采用 Waters-Xevo G2 Q-TOF 质谱 仪，配有 ESI 电喷雾离子源，负离子模式下进行检 测，选用亮氨酸脑啡肽作为校正液。雾化气（N2）体积 流量：600 L·h-1 ；锥孔气流量：50 L·h-1 ；脱溶剂气 温度：350 ℃；离子源温度（ESI- ）：110 ℃；锥孔电压：40 V；离子喷雾电压（ESI- ）：2.5 kV。MSE：扫 描模式检测；低能通道碰撞电压：6 V；高能通道碰 撞电压：20~80 V；扫描范围（m/z）：0 ~1 500。

2.1.3 人工胃液及人工肠液的配制

取 2.34 mL 浓盐 酸 加 水 定 容 至 10 mL 配 制 成 稀 盐 酸 。 取 稀 盐 酸 1.64 mL，加水约 80 mL 和胃蛋白酶 1 g，摇匀后， 加水定容至 100 mL，即得人工胃液，pH 值为 1.2。 取磷酸二氢钾 0.68 g，加水 50 mL 使溶解，用 0.4% NaOH 溶液调节 pH 值为 6.8，另取胰蛋白酶 1 g，加 水使溶解，将两液混合后，加水定容至 100 mL，即 得人工肠液。

2.1.4 苯甲酰芍药苷体外孵育实验

称取适量苯甲酰 芍药苷，配制成浓度为 7.5 mg·mL-1 的 0.5% 羧甲基 纤维素钠混悬液。人工胃液组与人工肠液组各取苯 甲酰芍药苷混悬液 1 mL，分别加入人工胃液及人工 肠液 5 mL，每组平行 6 份样品，混匀后将其放入摇床中（37 ℃，转速 200 r·min-1 ），分别于放入摇床的 0、0.5、1、4、8、12 h 取样 200 μL，加入 1 mol·L-1 NaOH 调节溶液 pH 值至 7，加入 1 mL 乙腈混匀，使 酶失活；离心（1 000 r·min-1 ，15 min），取上清液过 0.22 μm 微孔滤膜；用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 法检 测，采用 MSE 模式采集质谱数据，结合牡丹皮质谱 图库并利用 UNIFI 系统对采集得到的质谱数据进行 自动识别。UNIFI 数据库包括化合物名称、分子 式、实际相对分子质量、理论相对分子质量、保留 时间、误差、响应值等。依据碎片离子峰裂解规 律、化合物极性大小、数据库信息及相关对识 别出的化合物信息进行鉴定和确认。人工胃肠液孵 育实验所得总离子流图见图 1，说明苯甲酰芍药苷 在人工胃液和肠液中不发生代谢转化。结果只检测 到苯甲酰芍药苷原型，未检测到代谢产物。


3 讨论

UPLC-Q-TOF-MS/ MS 测定样品时，流动相使用乙腈-0.1%甲酸水，得 到的总离子流图基线平稳、峰形较好，且保留时间 稳定；但 UPLC 测定样品时发现 0.1%甲酸水会使基 线漂移，所以对甲醇-水（含甲酸）、乙腈-水、乙腈水（含磷酸）等流动相系统进行考察， 结果发现乙腈0.05%磷酸水为流动相时基线不漂移，并且得到的色 谱峰分离度、峰形均较好，且保留时间稳定，所以 选择乙腈-0.05%磷酸水作为 UPLC 的流动相。为确 保色谱峰的保留时间、峰形及分离度稳定，每次进 样前色谱柱以流动相起始浓度平衡 5 min。



 

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