博迅对滇重楼幼苗生长发育及甾体皂苷含量的影

滇重楼 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 为百合科重楼属 Paris L. 植物，主要分布于贵 州、云南和四川等地区，是《中国药典》2015 年版收 载的重楼药材的基原植物之一，其干燥根茎入药，具 有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，是“云 南白药”“宫血宁胶囊”等多种中成药的主要原料， 市场需求量较大。市场上的重楼药材多年以来主要依 赖于野生采挖，导致野生滇重楼药材几近枯竭，寻 求合适的栽培驯化滇重楼的方式迫在眉睫。

1 材料与试剂

2012 年 10 月，滇重楼 2 年生育苗的鲜种采自 云南省大理州农业科学院种植基地；2013 年 10 月， 滇重楼 1 年生实生苗和育苗栽培种源的鲜种采自贵 州省种植基地，滇重楼育苗野生种源的鲜种采自贵 州省野生环境，常温下河沙贮存 4 个月，并经三峡 库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验 室（重庆三峡学院）周浓教授鉴定为百合科植物滇 重楼 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 的成熟种子，种子采用单株保存、保证种质资 源的稳定性和均一性。

1.1 AM 真菌

通过美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心 购得相应的 AM 真菌纯净菌剂，其菌剂由三峡库区道 地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室（重庆三 峡学院）进行扩增繁殖、储存保管。接种菌剂为带有 孢子、菌丝及侵染后根段的栽培基质，见表 1。

1.2 试药

对照品重楼皂苷 I（批号 111590-201103）、重 楼皂苷 II（批号 111591-201103）、重楼皂苷 VI（批 号 111592-201103 ）、 重 楼 皂 苷 VII （批号 111593-200402）购自中国食品药品检定研究院，质 量分数均大于 98%。乙腈（德国默克公司，色谱纯）， 水（娃哈哈纯净水）。

1.3 仪器

DZF-6050MBE 型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；CP225D 型分析天平（德国 Sartorius 公司）；TDZ5-WS 型多管架自动平衡离心 机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）； SB-5200DTN 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技 股份有限公司）；LC-20A 型高效液相色谱仪、 UV2450 型紫外可见分光光度计（日本岛津集团）。

2 方法

2.1 实验设计

种子前处理，去除外果皮，用蒸馏水洗净，10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸馏水洗净，备用； 紫云英种子用 10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸 馏水洗净，备用。育苗栽培基质为菜园土与河沙的 混合物（体积比 3∶1，过 2 mm 筛，121 ℃高压 灭菌锅内灭菌 2 h）。2013 年 1 月、2014 年 1 月分 别将滇重楼 2 年生、1 年生实生苗育苗，采用室内 常温栽培法，设置 9 个处理组（AM 真菌组，S1～ S9）和 1 个对照组（CK 组，S10）共 10 组，每组 重复 10 次，每盆接种 180 个孢子的混合菌剂（均 分），与紫云英混合播种培养，待滇重楼种子出土 后除去紫云英植株，每盆间苗 20 株。滇重楼栽培 种源及野生种源新鲜种子于 2014 年 01 月与 AM 真菌混合共生育苗，采用室内常温栽培方法，设置 9 个处理组（AM 真菌组，S1～S9）和 1 个对照组 （CK 组，S10）共 10 组，每组重复 10 次，每盆接 种 180 个孢子的混合菌剂（均分），与紫云英混合 播种培养，待滇重楼种子出土后除去紫云英植株， 每盆间苗 20 株。滇重楼幼苗生长期间定期浇 Hoagland 营养液。 于 2015 年 6 月，采集栽培种源滇重楼育苗（T1） 和 1 年生滇重楼实生苗（T5）待测滇重楼样品，于 2015 年 7 月，采集 1 年生滇重楼实生苗（T6）待测 滇重楼样品，于 2015 年 8 月，采集栽培种源滇重楼 育苗家种（T2）、野生种源滇重楼育苗野生（T4）、1 年生滇重楼实生苗（T7）和 2 年生滇重楼实生苗（T8）待测滇重楼样品，于 2016 年 8 月，采集种子栽培种 源滇重楼育苗（T3）待测滇重楼样品。收获滇重楼的 根茎、根系，洗净后置于 35 ℃烘箱烘干，用于品质 分析；在冰水浴中洗净根系，剪成 1.0～1.5 cm 长的 根段，一部分置于福尔马林-醋酸-70％乙醇（FAA） 固定液中固定后用于菌根侵染率的测定。

2.2 AM 真菌的侵染率

随机选取浸泡于 FAA 固定液中滇重楼根系 30 条，采用 Philips 等的方法染色、制片、镜检，根 据 Trouvelot 等的方法统计菌根侵染率。

2.3 滇重楼幼苗叶片光合色素含量及生理指标的测定

根据张志良等的方法对滇重楼幼苗光合色 素含量测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外分 光光度法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创 木酚显色法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采 用氮蓝四唑法测定；丙二醛（MDA）和可溶性糖含 量采用硫代巴比妥酸法测定；可溶性蛋白含量采用 考马斯亮蓝比色法测定。

2.4 滇重楼幼苗生物量的测定

采收滇重楼后，测定各处理组新鲜根茎质量 后，分别置于 35 ℃烘箱中干燥至恒定质量，测定 不同处理组干质量，计算其折干率。

2.5 不同接种时期滇重楼幼苗根茎中重楼皂苷含量测定

采用《中国药典》2015 年版重楼药材项下测定 4 种重楼皂苷的含量。

2.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2003软件作图，运用SPSS 20.0 进行统计分析。

3 结果与分析

不同接种时期滇重楼幼苗根系均 在一定程度上受到了 AM 真菌的侵染，除 CK 组未 被侵染外，其他处理组的侵染率在 91.29%～ 100.00%，各实验组均无显著性差异（P＞0.05）， 这与周浓等的研究结果一致。而在自然条件下， AM 真菌的侵染率为 36.41%～83.7%。综上可知， 接种外源AM 真菌对滇重楼根系菌根侵染率具有一 定的促进作用，说明通过外源接种 AM 真菌以提高 滇重楼的品质具有可行性。与 CK 组相比，不同接种时期滇重楼 3 种保护酶 CAT、POD 和 SOD 的活性有不同 程度的提高。其中，T1、T5 时期的 POD 与 SOD 活 性提高更为显著。在不同的处理组中，S6、S8、S9 的 3 种酶活性提高更为明显。3 种保护酶的活性表 现为 POD＞SOD＞CAT，可能是因为 POD 活性对 环境变化表现的更为敏感。表明接种 AM 真菌有利 于滇重楼叶片保护酶活性提高。

4 讨论

研究结果表明，各处理组均能与 AM 真菌形成 一定的共生关系，但各处理组对滇重楼生长发育情 况的影响程度存在差异。与 CK 组相比，菌根化滇重楼的侵染率良好，即 AM 真菌与滇重楼幼苗 根茎形成了菌根，说明通过引入外源丛枝菌根真菌 可提高滇重楼幼苗的生活力。接种 AM 真菌有助 于光合色素含量的提高，进而促进滇重楼的生长发 育。现有研究表明，AM 真菌能激活植物对多种生 物或非生物胁迫的防御机制，从而提高植物的抗逆 性，包括对病虫害、重金属污染、盐害、干旱等胁 迫的抗性。CAT、POD 和 SOD 作为植物体内清 除自由基的关键保护酶，能起到清除活性氧、维持 氧代谢平衡的重要作用。与 CK 组相比，不同接 种时期滇重楼的 3 种保护酶活性均大于对照组，说 明接种 AM 真菌增强了植株对不利环境的抗性。 植株体内的渗透调节物质包括可溶性糖、可溶性蛋 白，其能帮助维系植物细胞内的膨压进而利于增强 植株的抗逆性。与对照组相比，滇重楼叶片的可溶 性糖的含量均有明显的增加，但可溶性蛋白变化不 明显。细胞膜系统的损伤是植物水分胁迫的重要原 因，叶片中 MDA 含量的增多与膜相对透性呈显著 正相关。各接种时期的 MDA 含量均低于对照 组，表明接种 AM 真菌的各处理组降低了受逆境 环境的胁迫程度。