乌鸡源多杀性巴氏杆菌杀禽亚种分析

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是引起畜禽巴氏杆菌病的病原菌，是一种革兰氏阴性短 杆菌，有荚膜，无鞭毛、不形成芽胞、不运动，可感染家禽、猪和牛等多种动物以及人，引起禽霍乱、猪肺疫和牛出血性败血症等多种传染病。多杀性巴氏杆菌病广泛流行于世界各地，目前在我国多种 家畜、家禽和野生动物中均有多杀性巴氏杆菌病发生，且发病率和死亡率均较高，给畜禽生产带来巨 大的经济损失，是危害畜禽养殖业的重要细菌传染病之一。因此，畜禽多杀性巴氏杆菌病的诊断和 防治至关重要。

1 试验材料

1.1 病料来源

江西省南昌市某鸡场送检发病乌鸡的肝脏等病料。

1.2 主要试剂和仪器

普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和 TSA 培养基，由实验室自制；小牛血清， 购自杭州江滨生物技术有限公司；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，购自北京全式金生物科技有限公司； 胶回收试剂盒，购自 Omega 公司；饱和酚、溴化乙锭（EB）、SDS、Tris 碱等，购自 Solarbio 公司；琼 脂糖购自 Sigma 公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 主要仪器

SW-CJ 型净化工作台，购自苏州净化设备有限公司；YXQ-LS-75S11 型立式压力蒸气灭菌器、 SPX-150B-Z 型生化培养箱，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；5415R 型冷冻台式高速离心机，购 自 Eppendorf 公司；K960 型 PCR 仪，购自杭州晶格仪器有限公司。

1.4 引物设计

分离株的 16S rRNA 基因序列的扩增采用细菌 16S rRNA 通用引物，引物由上海生工生物工程股份有 限公司合成。引物序列如下： 16S(F)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16S(R)5'-GGTTACCTTG TTACGACTT-3'。

2 试验方法

2.1 细菌分离

无菌取发病鸡肝脏，分别接种于鲜血琼脂培养基和普通琼脂培养基，在 37 ℃恒温箱中培养 24 h 后 进行观察，挑取可疑单个菌落进行纯化培养。

2.2 染色镜检

勾取纯化培养的单个菌落进行革兰氏染色，油镜镜检，观察记录其形态特征。

2.3 细菌

16S rDNA 鉴定

2.3.1 细菌

DNA 提取 取一支 1.5 mL EP 管，加入 100 μL 双蒸水，勾取 2 接种环纯化培养的单个菌落， 混匀，煮沸 10~15 min；12 000 r/min 离心 7 min，取上清，作为细菌 DNA 模板，-20 ℃保存备用。

2.3.2 细菌

16S rDNA 的 PCR 扩增 PCR 反应体系：总体积为 25 μL，其中含 16S (F)和 16S (R)各 1 μL、 PCR Mix 12.5 μL、DNA 模板 1 μL 以及 ddH2O 9.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 40 s， 55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 50 s，34 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 反应产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶进行 电泳，30 min 后在紫外灯下观察结果，并拍照记录。

2.3.3 16S rDNA 测序与序列分析

用胶回收试剂盒回收目的片段，将纯化回收的目的片段送至上海华大基因生物科技有限公司双向测通测序。运用 NCBI 基因库中的 BLAST 对获得的序列进行同源性检索， 与细菌 16S rRNA 基因序列进行对比，若同源性百分比≥99%，可以定义到种的水平；若同源性在 97%~98.9%，可以定义到属的水平；若＜97%，则定义为科。选取与分离菌 16S rDNA 基因序列同源性 高的细菌用 DNAStar 进行核苷酸同源性比对分析。

2.4 药敏实验

采用药敏纸片扩散法，取 100 μL 小牛血清涂布于 TSA 培养基，于 37 ℃恒温箱放置 5 min，干燥后 将药敏纸片贴于 TSA 培养基上，置于 37 ℃恒温箱中培养 24 h 后测量抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直 径＜10 mm 为耐药；抑菌圈直径在 10~15 mm 为中度敏感；抑菌圈直径＞15 mm 为高敏。

3 结果与分析

3.1 细菌分离结果

分离菌在鲜血琼脂培养基上形成圆形、边缘规则、表面光滑、乳白色的露滴状小菌落，无溶血现象 （图 1）；在普通琼脂培养基上几乎不生长。

3.2 染色镜检

分离菌经革兰氏染色后进行镜检，结果如图 2。可见分离株为革兰氏阴性的短杆菌，菌体两端钝圆， 呈单个散在分布或成双存在。可疑为多杀性巴氏杆菌，并命名为 JX-Pm01。

3.3 细菌

16S rDNA 鉴定

3.3.1 16S rDNA 基因 PCR 扩增结果

如图 3 所示，可以看到 1 条清晰的条带，且长度约为 1 500 bp， 与预期大小相符。

3.3.2 16S rDNA 基因测序与序列分析

分离株 JX-Pm01 的基 因片段长度为 1 443 bp，所得序列与 NCBI 基因库 BLAST 中多 杀性巴氏杆菌 16S rDNA 基因序列同源性达 100%，初步判定该 分离菌株为多杀性巴氏杆菌。选取 BLAST 同源性检索中与分离 菌同源性较高的多杀性巴氏杆菌杀禽亚种（Pasteurella multocida subsp. gallicida）、多杀性巴氏杆菌败血亚种（Pasteurella multocida subsp. septica）、咬伤巴氏杆菌（Pasteurella dagmatis）、 犬巴氏杆菌（Pasteurella canis）、咽巴氏杆菌（Pasteurella stomatis）、 口巴氏杆菌（Pasteurella oralis）、买氏巴氏杆菌（Pasteurella mairii）、产气巴氏杆菌（Pasteurella aerogenes）、豚放线杆菌 （ Actinobacillus porcinus ）、流感嗜血杆菌（ Haemophilusinfluenzae）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）、多源曼氏杆菌（Mannheimia varigena）、溶血性曼 氏杆菌（Mannheimia haemolytica）与分离菌 JX-Pm01 的 16S rDNA 基因序列进行同源性比对分析，结果如 图 4。 结果表明JX-Pm01 与巴氏杆菌核苷酸相似性达 91.3%~99.3%，与多杀性巴氏杆菌同源性达99.1%， 其中多杀性巴氏杆菌杀禽亚种与 JX-Pm01 同源性最高，达 99.3%，进一步表明分离株为多杀性巴氏杆 菌杀禽亚种。而与同科的豚放线杆菌、流感嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌、多源曼氏杆菌、溶血性曼氏杆 菌核苷酸同源性高达 91.4%~97.3%，说明巴氏杆菌各种属之间的差异性较小，尤其与咽巴氏杆菌的同 源性达 97.3%。


4 小结与讨论

试验从患病鸡肝脏分离到一株细菌 JX-Pm01，经染色镜检结合临床症状和病理剖检，可疑为多杀性 巴氏杆菌。经 16S rDNA 基因片段 PCR 扩增与测序分析，基本判定其为多杀性巴氏杆菌杀禽亚种。 多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱被 OIE 列为 B 类疫病，其发病率和死亡率均较高。及时准确诊断对 于该病的防治，降低养殖户的损失有重要意义。选用抗菌药物仍是防治霍乱的主要措施，然而耐药性的 产生，甚至是多药耐药基因，使本病的药物治疗效果不佳。本试验通过药敏试验，结果表明 JX-Pm01 对氨苄西林、丁胺卡那、多西环素和恩诺沙星敏感，对头孢哌酮、四环素、环丙沙星和复方新诺明中度 敏感，而对头孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考、红霉素、林可霉素和诺氟沙星耐药。这与边彦超等和王 彩丽等报道的多杀性巴氏杆菌对药物的敏感与本试验分离菌的耐药性存在不少差异。因此当养殖场发 生多杀性巴氏杆菌病时，需要根据药敏试验筛选药物进行科学用药，减少病原菌对抗生素耐药性的产生， 使其获得良好的治疗效果。