博迅分析五步蛇蛇毒的体外抑菌作用

抗生素的发现为人类对抗感染性疾病做出了巨 大的贡献。但是近些年来随着人们对抗生素的不 合理使用 甚 至 滥 用，直接导致大量耐药菌的产生， 常规的抗菌药物对于治疗常见的细菌感染也愈发困难。蛇毒是从毒蛇腺体中分泌的一种液体，主要 成分为一些活性酶类、多肽及蛋白质，占毒液干重 ９０％～９５％，还含有部分脂肪、碳 水 化 合 物、金 属 离子、核 苷、胺类以及游离氨基酸等。

１ 材料与方法

１．１ 实验材料与试剂

１．１．１ 实验菌株

金黄色葡萄球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ－ ｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ＣＭＣＣ２６００３）、甲型溶血性链球菌 ［α－ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＣＭＣＣ （Ｂ）３２２１３］、 枯 草芽胞 杆 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，ＣＭＣＣ６３５０１） 和 大肠埃希菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＣＭＣ４４１１３），以上 菌株均由广西医科大学微生物学教研室提供 （购自 中国食品药品检定研究院）。

１．１．２ 实验药品与试剂

广西眼镜蛇和五步蛇蛇毒 由广西医科大学蛇毒研究所提供，银环蛇蛇毒购自 义乌市蛇毒研究所，ＭＨ 营养琼脂、ＭＨ 肉汤培养 基粉由北京索莱宝科技有限公司提供，胎牛血清由 美国 ＧＩＢＣＯ 公司提供。

１．１．３ 实验仪器

ＺＨＷＹ－１１１Ｂ型恒温培养振荡器 （上海智城分 析 仪 器 制 造 有 限 公 司），ＭＰＪ１５０型 霉 菌培养 箱 （上 海 科 恒 实 业 发 展 有 限 公 司），YXQ-50SII型立式压力蒸汽灭菌锅 （上海博迅实业有限公司），ＭｉｃｒｏＣＬ１７Ｒ 型 高 速 低 温 离 心 机 （德 国 ＴＨＥＲＭＯＩＥＣ公 司），ＣＸ３１＋ＤＰ７３型 倒 置 显 微 镜（奥林巴斯有限公司），ＴＶ－１９０１型紫外可见分光光 度计 （北京普析通用仪器有限公司），ＤＫ－９１４型恒 温水浴锅 （上海森信仪器有限公司）。

１．２ 实验方法

１．２．１ 细菌培养

分别将甘油冻存的金黄色葡萄球 菌、甲型溶血性链球菌、大肠埃希菌和枯草芽胞杆 菌室温 融 化 后，划 线 接 种 至 ＭＨ 营 养 琼 脂 平 板， ３７ ℃培 养 箱 培 养１８～２４ｈ，挑 取 典 型 菌 落 接 种 至 ＭＨ 肉汤培养基，３７ ℃恒温振摇箱孵育１６～１８ｈ， 转速２００ｒ／ｍｉｎ。

１．２．２ 细菌浓度标准曲线的绘制及菌悬液制备

将 孵育好的细菌室温下１０００ｒ／ｍｉｎ （离心半径４．３ｃｍ） 离心４５ｓ收集菌液，重复用无菌生理盐水洗脱２次， 按倍数稀释法用无菌生理盐水依次稀释原菌液作为 实验组，其对应的无菌生理盐水作为空白对照，利 用紫外分光光 度 计 测 定 细 菌 在６００ｎｍ 时 的 吸 光 度 （Ａ）值，以Ａ 值为横坐标，菌液浓度为纵坐标，分 别绘制４种细菌的标准曲线，得到回归方程。确定 所用原菌液浓度为１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ 的 Ａ 值，然后 １∶１００用 ＭＨ 液体培养基稀释至 １×１０６ ＣＦＵ／ｍＬ 备用。

１．２．３ 蛇毒储存液配制

取３种蛇毒分别溶于无菌 生理盐水中，浓度不低于初始实验浓度的１０倍，经 ０．２２μｍ 无菌微孔滤膜过滤除菌，于－２０ ℃冷冻保 存备用。

１．２．４ ＭＩＣ测定

分别制备３种蛇毒的 ＭＩＣ 测定 板，首先在９６孔板所有的 Ｖ孔内依次加入 ＭＨ 肉汤 培养基各１００μＬ。其次，各在 Ｂ／Ｃ／Ｄ 三排的第１个 Ｖ 孔内加配好的蛇毒１００μＬ，使第１个孔内的初始 浓度为１２８０μｇ／ｍＬ，混匀后依次对药物进行二倍 稀释，即第１个孔中加入药液后用移液枪充分吹打 使药物 与 肉 汤 充 分 混 匀，然 后 吸 取 １００μＬ 加 入 第２个孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照 此 重 复至最后一孔，混匀后从第１２列吸出１００μＬ弃掉。 最后，再在 Ｂ／Ｃ／Ｄ三排的每一孔中加入稀释好的菌 液１０μＬ，使每个孔内菌液浓度为１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。 在 Ａ 排上做一排阴性对照 （只 加 ＭＨ 肉 汤 不 加 菌 液）和在 Ｈ 排上做一排阳性对照 （只加菌液不加药 液），详 见 表 １。将 ９６ 孔 板 放 入 ３７ ℃ 恒 温 培 养 箱 （内置湿盘保持湿度）培养。

１．２．５ ＭＩＣ值 结 果

读 取 分别观测读取培养 ２４、 ４８和７２ｈ后的 ＭＩＣ５０、ＭＩＣ８０和 ＭＩＣ１００结果，当阳 性对照孔内细菌明 显生长时， 采用目测法读取 ＭＩＣ５０、ＭＩＣ８０和 ＭＩＣ１００数值。以肉眼能观察到在小 孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度 为 ＭＩＣ１００； 以肉眼能观察到在小孔内抑制８０％细菌生长的最低 药物浓度为 ＭＩＣ８０；以肉眼能观察到在小孔内抑制 ５０％细菌生长的最低药物浓度为 ＭＩＣ５０。

２ 结 果

对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞 杆菌，广西眼镜蛇蛇毒的抑菌作用最强，五步蛇蛇 毒的抑菌作用次之，银环蛇蛇毒最弱；对于甲型溶 血性链球菌，五步蛇蛇毒的抑菌作用强于广西眼镜 蛇和银环蛇。对于革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、甲 型溶血性链球菌和革兰阴性菌大肠埃希菌、枯草芽 胞杆菌，广西眼镜蛇蛇毒对革兰阳性菌的 ＭＩＣ值均高于其对革兰阴性菌的 ＭＩＣ值２倍或２倍以上，提 示革兰阳性菌对广西眼镜蛇蛇毒敏感度低于革兰阴 性菌的。

３ 讨 论

实验结果表明广西眼镜蛇蛇毒对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、大肠埃希 菌和枯草芽胞杆菌均有不同程度的抑制作用，且作 用较为明显，推测其主要原因可能为：细胞毒素是 眼镜蛇蛇毒的主要活性成分，约占蛇毒总蛋白质含 量的４０％，具有较强的细胞毒性。细胞毒素与细 菌的细胞膜结合后，通过改变细胞膜的通透性，造 成细胞膜破损，产生穿孔现象，从而导致细胞膜内 容物外 渗，进 而 使 细 菌 死 亡。与 革 兰 阴 性 菌相比革兰阳性菌有较厚的肽聚糖，且革兰阳性菌的 细胞壁比较厚，这可能是广西眼镜蛇蛇毒对革兰阳 性菌的抑菌效果比革兰阴性菌差的原因之一。实验 数据表明五步蛇蛇毒也具有一定的抗菌作用，可能 与五步蛇蛇毒中也含有少量细胞毒素有关，五步 蛇蛇毒对甲型溶血性链球菌的抑制作用比较强，原 因有待进一步研究。银环蛇蛇毒无明显抑菌作用可 能与其蛇毒成分中以神经毒素为主有关，神经毒素 毒性较强，可有神经肌肉阻断作用，严重时可导致 外周呼吸麻痹引起死亡，但小剂量的神经毒素可 能仍不足以对细菌有抑制作用。