长尾仓鼠SSR位点的筛选与扩增-水浴锅使用

1991 年，MOORE 等提出了微卫星 DNA（Microsatellite DNA）的概念，即 SSR（Simple Sequence Repeats）位点，是一类由 1～6 个核苷酸为重复单位 组成的长达 200～800 bp 的核苷酸串联重复序列。 微卫星位点中大量重复的部分很可能存在变异，变 异会表现为数目的整倍性不同或序列的不完全相 同，因而造成位点的多态性。而揭示这些变异，进而 发现不同的 SSR 在不同的种甚至不同个体间的多 态性，是 SSR 标记技术的目的。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物材料

在野外捕获活体长尾仓鼠后，取 其尾尖为 DNA 提取材料。捕获地及数量见表 1。

1.1.2 试剂

血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取 试剂盒 （天根生化科技有限公司），2×Taq PCR MasterMix 酶（天根生化科技有限公司），ddH2O，琼 脂糖，1×TAE，30%聚丙烯酰胺（生工生物工程股份 有限公司），5×TBE，过硫酸铵，TEMED，GeStain 染 液（全式金有限公司），NaCl。

1.1.3 仪器

电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；微型高速离心机 Centrifuge 5424 （北京伯乐生命科学发展有限公司）；琼脂糖凝胶电 泳槽（北京六一仪器厂）；聚丙烯酰胺凝胶电泳槽（北 京六一仪器厂）；凝胶成像系统（Alphalmager HP）； G1000 基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）；DNA 定量仪 NANODROP 2000（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成

试验所采用的引物借鉴 了与长尾仓鼠同属的黑线仓鼠 SSR 位点引物， 并由生工生物工程股份有限公司合成。具体序列以 及特点列于表 2。

1.2.2 长尾仓鼠基因组DNA的提取

采集长尾仓鼠尾尖作为 DNA 提取材料，用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测有目 标条带后，对其进行定量分析。

2 结果与分析

1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 含量和质量， DNA 提取结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定观察结果如 图 1 所示，质量较好。经 DNA 定量分析，其浓度平 均达到 1.8 ng/μL，表明浓度足够，符合进行 SSR 位 点扩增的试验要求。应用与长尾仓鼠同属的黑线仓鼠 SSR 引物扩 增后的电泳结果显示，引物 SSRf6 的扩增结 果（F）不明显，长尾仓鼠很可能不存在这一位点，其 他 5 个位点表现的多态性都较好。

3 讨论

非变性聚丙烯酰胺凝胶具有很高的分辨力，能 很好地分离小片段 DNA（5～500 bp），甚至可以分 离相差 1 bp 或分离单碱基突变所引起的不同片 段。但不同浓度会影响扩增条带的清晰度。本研究 为了确定分离片段所需最适聚丙烯酰胺的浓度进 行了预试验，分别测试了 8％，10％，12％的聚丙烯 酰胺凝胶，从预试验结果来看，8％的聚丙烯酰胺 凝胶带型最整齐且杂带少，便于观察分析试验结果。