米粉中阪崎克罗诺杆菌的耐受性研究

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一 种革兰氏阴性致病菌，常污染乳及乳制品，可引起 严重的新生儿脑膜炎、 坏死性小肠结肠炎和败血 症，死亡率高达 50%以上。 即使治愈，也可能使 神经系统产生后遗症。 近几年，随着国内外一系 列与阪崎克罗诺杆菌相关的污染事件的爆发，该 菌受到研究者的广泛关注。 目前，对阪崎克罗诺 杆菌确切的污染来源尚不清楚， 许多病例表明婴 幼儿配方乳粉是该菌的主要感染载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

阪崎克罗诺杆菌标准菌株 ATCC BAA-894 由中国食品药品检定研究院提供，分离 于婴幼儿配方乳粉和米粉中不同基因型的阪崎克 罗诺杆菌 11-19 （1）、12-4 （1）、12-8 （1）、12-13 （2）、13-8（2）、13-2（1）、14-20（1）、14-15（2）、14-4 （1）、15-9（2）、18-16（1）、18-8（1）、18-24（1）、18- 12（2）和 18-14（1）由西北农林科技大学食品科学 与工程学院微生物研究室提供。 供试代表性菌株 选择标准： 分离于不同时间采集的不同品牌的婴 幼儿乳粉或米粉， 具有不同耐药表型和基于脉冲 场 凝 胶 电 泳 （Pulsed field gel electrophoresis， PFGE）的基因型，携带不同毒力基因。 产乳酸菌素 乳酸菌由西北农林科技大学食品科学与工程学院 吕欣博士惠赠。

1.1.2 材料与试剂

LB 琼脂培养基、LB 肉 汤 培 养基、MH 琼脂培养基（MHA）和脑心浸液培养基 （BHI），购自北京陆桥技术有限责任公司；妈咪爱， 购自北京韩美药品有限公司； 制作菌悬液用婴幼 儿配方乳粉，购于陕西杨陵好又多超市，为适于较 大婴儿及幼儿食用的 2 段配方牛乳粉。

1.1.3 主要仪器

高压灭菌锅 （LAC-5080S），上海博讯；超净工作台（SW-CJ-1CU），苏州泰安；微 量移液枪（Effendorf），德国；百分之一天平（XS204）， 梅特勒；恒温培养振荡器（ZHWY-211B），上海智 诚。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和扩大培养

用接种环分别蘸取 少量保存于-80 ℃ LB 肉汤/甘油（50%/50% V/V） 中的阪崎克罗诺标准菌株和分离株， 划线接种到 LB 琼脂培养基表面，37 ℃培养 18～24 h。 从 LB 培 养基上挑取一个单菌落， 接种到 20 mL BHI 肉汤 中，37 ℃、100 r/min 下摇床培养 10 h。

1.2.2 菌液初始浓度测定和存活率计算

取 1 mL 阪崎克罗诺杆菌 BHI 肉汤培养物，用生理盐水 依 次 进 行 10 倍 稀 释， 分 别 得 到 其 101 ，102 ，103 ， 104 ，105 和 106 倍稀释液。 分别取各稀释液 50 μL 接种于 LB 平板上， 涂布均匀后 37 ℃下倒置培养 18 h， 计数。 同时接种 50 μL 无菌生理盐水于 LB 平板表面作为阴性对照。 每个稀释度（包括对照） 共做 3 个重复。 选择菌落分布均匀且皿内菌落数 在 30～300 CFU 的稀释度的菌落数计算菌液的起 始浓度。

1.2.3 阪崎克罗诺杆菌对温度的耐受性测定

结合日常生活中乳粉冲调时使用的水温， 分别选取 50，60 和 70 ℃ 3 个温度点进行研究。 取 1.2.1 节 中的 BHI 肉汤培养物 1 mL 加入到灭菌的装有 10 mL 冲调乳粉（用矿泉水按照乳粉生产商的推荐比 例冲调，下同）的 50 mL 离心管中，振荡混匀，将离 心管分别置于 50，60 和 70 ℃的水浴中保温处理 20 min，保温过程不断进行振荡使菌体受热均匀。 处理结束后，按照 1.2.2 节所述方法，立即取样测定阪崎克罗诺杆菌的浓度并计算存活率， 采用存 活率衡量其对温度的耐受性。

1.2.4 阪崎克罗诺杆菌对 pH 的耐受性测定

将 冲调好的乳粉高温灭菌后， 使用无菌 HCl 和/或 NaOH 调整其 pH 为 4.0，6.0 和 8.0， 确定每个离 心管中调整 pH 值后的乳粉体积为 20 mL 后，分 别向其中 加 入 1 mL 1.2.1 节 中 的 BHI 肉 汤 培 养 物，振荡匀后室温下静置 20 min。 处理结束后，按 照 1.2.2 节所述方法，立即取样测定阪崎克罗诺杆 菌的浓度并计算存活率，采用存活率衡量其对 pH 的耐受性。

2 结果与分析

阪崎克罗诺杆菌经 50，60 和 70 ℃处理后的 存活率见表 1。 50 ℃处理后，除 12-8（1）和 14-15 （2）死亡较多外，其它菌株基本没有死亡，大部分 菌株反而呈生长态势。 当温度上升到 60 ℃时，所 有菌株都呈现出死亡的趋势。70 ℃时，所有菌株的 存活率都低于 0.11%。 对 3 种温度处理后阪崎克 罗诺杆菌浓度的对数值方差分析和多重比较结果表明：50，60 与供试菌株在 pH 4.0，6.0 和 8.0 条件下处理后 的存活率。 3 种 pH 条件处理后，大部分菌 株出现不同程度死亡。 13-2（1）的死亡率均相对较 高，说明该菌对 pH 比较敏感。 18-8（1）、18-16（1） 和 18-12（2）经 pH 处理后还出现增长态势，表明对 pH 的耐受性非常强。阪崎克罗诺杆菌经 3 种 pH 处理后存活率方 差分析和多重比较结果表明：pH 4.0 条件处理与 pH 6.0 和 pH 8.0 条件处理后菌液浓 度的对数值在 1%水平上存在极显著差异。 pH 6.0 与 pH 8.0 条件处理后菌株存活率无显著性差异。菌株 12-4（1）对乳酸菌最敏 感，而 14-4（1）和 15-9（2）的耐受性较强，表明产 乳酸菌素的乳酸菌对阪崎克罗诺杆菌生长具有一 定的抑制， 多重比较结果表明不同菌株对乳酸菌 的敏感性具有极显著的差异。

3 讨论

阪崎克罗诺杆菌是一种常见的食源性条件致病菌，在婴幼儿乳粉、米粉、奶酪、面包及豆腐等多 种食品中均被检出。 自 Muytjens 等于 1983 年 从冲调乳粉的器具上分离到阪崎克罗诺杆菌，继 而将其与婴幼儿乳粉联系起来后，世界多地，如： 美国、丹麦、冰岛和新西兰等，均出现了由阪崎克 罗诺杆菌引起的疾病暴发。 2011 年，在美国俄克 拉马州和密苏里州相继发生了婴儿感染阪崎克罗 诺杆菌致死的事件，之后，美国的沃尔玛超市及一 些零售商开始大规模召回婴幼儿乳粉。 这些事 件的爆发表明研究与乳粉密切相关的阪崎克罗诺 杆菌具有十分重要的意义。