区感染性腹泻标本常见病原菌谱-博迅分析

感染性腹泻是一组由细菌、病毒和原虫等多种肠 道病原体感染引起的，以腹泻症状为主的肠道传染病， 广泛流行于世界各地，由于该病发病率高、流行极其广 泛，已成为全球尤其是发展中国家的重要公共卫生问题。细菌性腹泻在感染性腹泻中所占比例较高，其 常见病原菌有沙门菌、肠致泻性大肠埃希菌( diarrheagenic Escherichia coli，DEC) 、弧菌、志贺菌、气单胞菌、 空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、艰 难梭菌、蜡样芽胞杆菌、克罗诺杆菌、单增李斯特菌等。腹泻病人粪便标本中病原菌的分布各地不同， 主要取决于当地的致病菌谱、主要流行菌株和当地人 群的免疫状况等，北京地区沙门菌、DEC 和副溶血性 弧菌检出率较高。

1 材料与方法

1. 1 标本来源

本辖区哨点医院肠道门诊 2017 年 5 月－2018 年 4 月感染性腹泻患者的 380 份( 1－3、11－ 12 月各 20 份，其他月份各 40 份) 粪便标本，患者的选 入标准为: 每日排便≥3 次，大便性状改变( 呈稀便、水样便、黏脓便或脓血便等) ，且均未服用抗生素。用无 菌棉签采集标本后，保存于 Cary－Blair 运送培养基，按 生物安全要求于采样当天送至监测实验室。

1. 2 试剂与仪器

XLD 培养基、血平板、CCI 培养基 和 EC 肉汤( 英国 OXOID) ; 大肠杆菌、沙门菌和弧菌显 色培养基( 法国科马嘉) ; ＲS 和 CN 培养基( 北京陆 桥) ; 空肠弯曲菌双孔滤膜法培养检测试剂盒( 青岛中 创) ; SBG 增菌液和 3% NaCl 碱性蛋白胨水( 友康恒业 生物科技) ; Genbag 微需氧产气袋和 VITEK GN/GP 鉴定卡( 法国生物梅里埃) ; 志贺菌诊断血清和副溶血 弧菌诊断血清( 日本 Denka Seiken) 、沙门菌诊断血清 ( 丹麦 SSI) 、生物安全柜(上海博迅) 、恒温培养箱( 日 本 SANYO) 、全自动细菌鉴定仪 VITEK 2 和浊度仪( 法 国生物梅里埃) ，Premix Ex TaqTM( Probe qPCＲ) 购自 大连宝生物公司; 7 对特异性基因( eae、stx1、stx2、lt、 st、ipaH、aggr) 引物及探针由北京市疾病预防控制中 心提供。

1. 3 病原菌检测方法

沙门菌、DEC、副溶血性弧菌 和志贺菌的分离、生化鉴定及血清学分型按照《感染 性腹泻诊断标准 WS271－2007》和《细菌性和阿米巴性 痢疾诊断标准 WS287－2008》; 气单胞菌用 ＲS 平板进 行选择性分离( 37 ℃，18 ～ 24 h) ，可疑菌落为黄色; 铜 绿假单胞菌用 CN 平板进行选择性分离( 37 ℃，18 ～ 24 h) ，可疑菌落为蓝/绿色菌落、产荧光的非蓝/绿色菌落和红褐色菌落; 金黄色葡萄球菌用 7. 5%氯化钠 肉汤进行增菌( 37 ℃，18～24 h) ，之后用血平板进行选 择性分离( 37 ℃，18～24 h) ，可疑菌落较大、圆形、光滑 凸起、湿润、金黄色( 有时为白色) 、周围可见完全透明 溶血圈; 克罗诺杆菌用 MLST －Vm 肉汤( 44 ℃，18 ～ 24 h) 进 行 增 菌，之 后 用 CCI 平板进行选择性分离 ( 37 ℃，18 ～ 24 h) ，可疑菌落为蓝绿色; 空肠弯曲菌的 分离鉴定详见空肠弯曲菌双孔滤膜法培养检测试剂盒 说明书。用全自动细菌鉴定仪 VITEK 2 对所有可疑菌 进行生化鉴定，诊断血清进行血清学分群，PCＲ 进行 DEC 特异性基因的分析，其中肠致病性大肠埃希菌 ( enteropathogenic Escherichia coli，EPEC) : eae 阳性; 肠 出血性大肠埃希菌( enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC) : eae、stx1 和 stx2 阳性，或 eae 和 stx1 阳性，或 eae 和 stx2 阳性; 肠产毒性大肠埃希菌( enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC) : lt 和 st 阳性，或 lt 阳性，或 st 阳性; 肠侵袭性大肠埃希菌( enteroinvasive Escherichia coli，EIEC) : ipaH 阳性; 肠集聚性大肠埃希菌( enteroaggregative Escherichia coli，EAEC) : aggＲ 阳性。

1. 4 数据分析

采用 SPSS 20. 0 软件进行统计学分 析，计数资料使用 χ2 检验，P＜ 0. 05 为差异有统计学 意义。

2 结 果

在 380 份感染性腹泻患者粪 便标本中，检出病原菌 189 株，检出率为 49. 74%，其中 29 份粪便标本中检出≥2 种病原菌。除常规监测工作 中主要监测的 DEC( 构成比 13. 76%) 、副溶血性弧菌 ( 构成比 10. 58%) 、沙门菌( 构成比 10. 05%) 和志贺菌 ( 构成比 0. 53%) 外，还检出金黄色葡萄球菌、气单胞 菌、克罗诺杆菌、空肠弯曲菌、河弧菌、非 O1 /O139 群 霍乱弧菌等 6 种腹泻相关病原菌和肺炎克雷伯菌、产 酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌等 3 种机会致病菌。在 189 株病原菌中检出率最高的是肺炎克雷伯菌( 构成 比 19. 05%) ，其次为金黄色葡萄球菌 ( 构 成 比 17. 99%) 。同一菌属中的进一步分群发现，沙门菌中 主要为肠炎沙门菌( 占 36. 84%，7 /19) ，DEC 中 EPEC ( 占 42. 31%，11 /26) 和 ETEC( 占 38. 46%，10 /26) 检出 较多，副溶血性弧菌的主要血清型为 O3: K6 ( 占 69. 57%，16 /23 ) ，气单胞菌以温和气单胞菌 ( 占 76. 47%，13 /17) 为主，克雷伯菌中主要为肺炎克雷伯 菌( 占 94. 74%，36 /38) 。

3 讨 论

细菌性腹泻是全球性的公共卫生问题，引起细菌 性腹泻的病原菌种类多，且各地腹泻病人粪便标本病 原菌检出情况不一。本研究结果显示，北京市昌 平区腹泻患者粪便标本中机会致病菌肺炎克雷伯菌检 出率最高，其次为金黄色葡萄球菌，之后才是常规监测 ( 沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、志贺菌、DEC、弯曲 菌和小肠结肠耶尔森菌) 中的 DEC、副溶血性弧菌和沙 门菌，其他 5 种病原菌( 气单胞菌、空肠弯曲菌、志贺 菌、克罗诺杆菌、铜绿假单胞菌) 也有检出。