浅谈毛脉酸模次生代谢产物的影响原因分析

内生真菌( endophytic fungi) 是指生活在植物体 内的一类真菌，在寄主中度过全部或近乎全部生活周 期而不使寄主表现任何症状，可以经对植物组织内直 接扩增微生物 DNA 的方式来证明其在内部的真实存。内生真菌广泛存在于植物的健康组织内，是植 物微生态系统的重要组成部分。在长期的进化过程 中，一些共存的内生真菌与其宿主植物相互建立了特 殊的关系，这种关系可以显著影响植物中有效成分的 形成，从而影响药用植物的质量和数量。

AE240 分析天平( 瑞士 METTOEＲ TOLEDOGO公司) ; 光照培养箱( 杭州汇尔仪器设备有限公司) ; BGZ-240 电热鼓风干燥箱( 上海博迅实业有限公司 医疗设备厂) ; 立式压力灭菌器( 上海博迅实业有限 公司医疗设备厂) ; BJ-1CD 洁净工作台( 上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ; LT501E 电子天平( 常 熟市天量仪器有限责任公司) ; 生化培养箱( 上海博 迅实业有限公司医疗设备厂) ; 振荡培养箱( 上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ; FS-1 型可调高速匀 浆机( 上海比朗仪器有限公司) ; KDM 型调温电热套 ( 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司) ; Ｒ201 旋转蒸 发仪( 瑞士布奇 BUCHI) ; e2695 型高效液相色谱仪 ( 美国 waters 公司) ; WND200 中药粉碎机( 伟能达 电器有限公司) 。

毛脉酸模 Ｒumex gmelini Turcz． 种子取自黑龙江 中医药大学药用植物园，经黑龙江中医药大学王振 月教授鉴定。毛脉酸模内生真菌，由课题组前期分 离得到菌株 J-G( Plectosphaerella Sp． ) 。 MS 培养基( 不含琼脂和蔗糖，青岛宾得生物技 术有限公司) ; 琼脂( 北京奥博星生物技术有限责任公 司) ; 无水乙醇( 天津天力化学试剂有限公司) ; 白藜 芦 醇 苷 对 照 品 ( 批 号: MUSH-1616062102，纯 度 99． 78% ) 、白藜芦醇对照品( 批号: MUSH-12032106， 纯度99． 50% ) 均购自成都曼思特生物科技有限公司; 大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品( 批号: CS1611TZ01，纯 度 98%，上海澄绍生物科技有限公司) ; 酸模素对照 品( 批号: AB161206054，纯度 98%，成都埃法生物科 技有 限 公 司) ; 芦荟大黄素对照品( 批 号: 110795- 201609，纯度98． 1% ) 、大黄酸对照品( 批号: 110757- 201607，纯度99． 3% ) 、大黄素对照品( 批号: 110756- 200110，纯度99． 5% ) 、大黄酚对照品( 批号: 110796- 201017，纯 度99． 6% ) 、大黄素甲醚对照品( 批 号: 110758-201013，纯度99． 8% ) 均购自中国食品药品检 定研究院。 

将冷藏于试管中的 毛脉酸模内生真菌 J-G 取出，用 75% 乙醇对试管表 面消毒后，置于经紫外灭菌 30 min 的超净工作台 中，用酒精灯灼烧接菌环的上半部分，待接菌环冷却 后，使试管倾斜 45°，将接菌环伸入试管中，挑取部 分菌丝接入经高压灭菌的新鲜的 PDA 培养基，将接 过菌的新鲜培养基放入培养箱，28℃暗培养 1 周。真菌 J-G 接入经高压灭菌的液态 PDB 培养基中，在震荡培养箱中 28℃无光条件以 120 r·min － 1 的转速 震荡培养。培养 7 d 后，从摇瓶中收获真菌，用抽滤 机将菌丝滤出，并用蒸馏水洗涤数次。将每 10 g 新 鲜真菌生物量重新悬浮于 100 ml 蒸馏水中，通过匀 浆机强烈机械搅拌后，高压灭菌。灭菌的真菌匀浆 作为实验中的诱导剂。将饱满的毛脉酸 模种子用 120 目砂纸摩擦后，放入蒸馏水中浸泡 24 h，然后将种子取出，用 75% 的酒精浸泡 2 min，用无 菌水冲洗 3 次，再用 2% NaClO 浸泡 10 min，然后无 菌水冲洗 5次。将处理过的种子接种于无菌的 MS 固体培养基( MS + 蔗糖 + 琼脂) 上，每个培养皿 中均匀接入 10 粒种子，用封口膜将培养皿封住，放 置于光照培养箱中在培养温度( 昼/夜) 25 ℃ /18 ℃、光照周期 14 /10 h、光照强度 3 000 Lx 的条件下 培养，至种苗长出 3 片真叶。以上种子消毒及接到 MS 培养基的过程均需在超净工作台中进行。选取 54 瓶长 势一致的毛脉酸模无菌苗，分 18 组，每组 3 瓶，在洁 净工作台中，用无菌注射器向 27 瓶含有毛脉酸模无 菌苗的锥形瓶中注入制备好的内生真菌诱导子 5 ml，其余 27 瓶作为空白对照，培养条件与放置于光 照培养箱中在培养温度( 昼/夜) 25 ℃ /18 ℃、光照 周期 14 /10 h、光照强度 3 000 Lx 的条件下培养，每 5 d 更换一次培养基，分别在培养 5，10 ，15 d 的时 候收获试验组( 各 3 组) 和空白对照组( 各 3 组) 的 植物根部。

本研究利用内生真菌 J-G 诱导子与毛脉酸模幼 苗共培养，在不同培养时间检测实验组幼苗相对于 空白对照组的含量变化，结果发现白藜芦醇和白藜 芦醇苷等二苯乙烯类成分含量显著提高，酸模素和 蒽醌类成分含量在诱导过程中呈现先增高后降低的趋势。由此发现诱导子短时间( 5 d) 作用对毛脉酸 模中次生代谢产物的积累具有显著的促进作用。诱 导子是内生真菌菌丝灭活制得的，化学本质是无毒 力作用的寡糖、蛋白质等，因此不会对植株的生长产 生抑制作用，可能由于内生真菌的诱导子特异性地 诱导了特定基因的表达，触发植物细胞间复杂的反 应，导致次生代谢产物的合成和积累。



 

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