分享枯草芽胞杆菌增殖中的应用

0 引 言

蛋白胨（peptone）是由䏡、胨、肽和氨基酸组成 的水溶性混合物，是微生物生长发育和繁衍的重要 氮素营养 。随着生物医药产业的快速发展和人们 对微生物发酵技术的重视，蛋白胨的用量逐年增大。 虽然蛋白胨的生产路线短、工艺简单，但其货源仍旧 比较紧张，价格昂贵。开发新的蛋白胨资源和研 究新的制备工艺意义重大。蛋白胨不仅可用于微生 物培养基制备，还是医药生产、商品检验、卫生防疫、 临床化验和疫苗、毒素等生物制品生产及菌种培养 分离与鉴别的重要生化试剂 。

1 材料与方法

1. 1 供试材料与主要试剂

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）为本实验室保 藏菌种；琼脂粉，上海山浦化工有限公司，生化级；牛 肉膏和胰蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司，生化 级；酪蛋白，上海伯奥生物科技有限公司，生化级； NaOH、KH2PO4、NaCl、H2SO4、CuSO4、K2SO4、 Li2SO4、HCHO、Na2WO4·2H2O、Na2MoO4·2H2O、氨 基苯磺酸⁃α⁃萘胺、苯酚，国药集团化学试剂有限公司，分析纯；胃蛋白酶、碱性蛋白酶，广西庞博生物工 程有限公司，生化级。

1. 2 主要仪器与设备

DK⁃98⁃11A 型电热恒温水浴箱，天津市泰斯特 仪器有限公司；UV ⁃2500 紫外可见分光光度计，日本岛津；IRPrestige⁃21 岛津傅立叶变换红外光谱仪， 日 本 岛 津 ；HERMLE Z323K 冷 冻 离 心 机 ，德 国 Hermle 公司；PHS ⁃3C 型 pH 计，上海雷磁仪器厂； AL204 分析天平，梅特勒⁃托利多；DF ⁃101S 集热式 恒 温 加 热 磁 力 搅 拌 器，郑 州 予 华 仪 器 制 造 有 限 公 司；上海博迅YXQ-50SII立式压力蒸汽灭菌器；L550⁃台式低速离心机，湘仪离心机仪 器有限公司；KDN ⁃08C 凯氏定氮仪，杭州托普仪器 有限公司。

1. 3 试验方法

1. 3. 1 冷榨花生粕蛋白胨的制备工艺

准确称取脱脂冷榨花生粕 5 g 溶解于 250 mL 去 离子水中，用盐酸调 pH 至 2. 0，加入 5% 的胃蛋白酶 （以底物为基准，3 000 U/g）并于 37 ℃搅拌条件下酶 解 200 min，定 期 监 测 其 水 解 度（degree of hydroly⁃ sis，DH%）变化；水解完成后，将水解液用 NaOH 调 节 pH 至 8. 0，加入 2% 碱性蛋白酶（以底物为基准， 50 000 U/g），于 50 ℃搅拌条件下酶解 190 min，定期 监测 DH%；水解全部完成后将酶解液置于沸水浴 中 10 min 灭酶。冷却至室温后于 4 ℃，5 000×g 离 心 25 min，取上清液冷冻干燥，即冷榨花生粕蛋白胨 （cold⁃pressed peanut meal peptone，CPMP）。

1. 3. 2 一般性状检查

①颜色、澄清度和沉淀检查 准确称取 1. 0 g 花生蛋白胨放入 50 mL 去离子 水中（100 mL 烧杯），加热煮沸使其溶解。冷却至室 温后观察溶液颜色、澄清度和沉淀 。结果判定标 准：颜色分为无色、微黄、浅黄、黄色、深黄、浅棕和棕 色；澄清度分为澄清、微混和混浊；沉淀分为无、微 量、少量和多量。以细菌胰蛋白胨为标准。
②碱性沉淀检查 准确称取 2. 0 g 花生蛋白胨，加入 100 mL 去离 子水于 250 mL 三角瓶中，用 0. 1 mol/L NaOH 调节 pH 8~9，121 ℃高压灭菌 30 min，冷却至室温后观察 溶液澄清度和沉淀情况 。
③磷酸盐沉淀检查 准确称取 2. 0 g 花生蛋白胨、KH2PO4 0. 5 g，加入 100 mL 去 离 子 水 于 250 mL 三 角 瓶 中 ，用 0. 1 mol/L NaOH 调 节 pH 7. 4~7. 6，121 ℃ 高 压 灭 菌 30 min，冷 却 至 室 温 后 观 察 溶 液 澄 清 度 和 沉 淀 情况 。
④ pH 值测定 准确称取 1. 0 g 花生蛋白胨，加入 50 mL 去离子 水，加热煮沸后使其溶解，冷却至室温，用 pH 计测定 溶液 pH 值。

1. 3. 3 蛋白胨化学指标测定

水分含量测定根据 GB 5009. 3-2016 测定； 灰分根据 GB 5009. 4-2016 测定 ；总氮采取微量 凯氏定氮法测定 ；氨基氮含量采取甲醛滴定法测定 ；蛋白胨含量采取双缩脲法测定 ；糖含量采取 苯酚硫酸法；亚硝酸盐法采取氨基苯磺酸⁃α⁃萘胺试 液测定；磷含量采取比色法（测定波长 820 nm）测 定 。氯化钠含量采取滴定法测定 。

1. 3. 4 枯草芽胞杆菌增殖培养试验

Luria⁃Bertani 培养基（LB 培养基）配方：胰蛋白 胨 10. 0 g，酵 母 提 取 物 5. 0 g，NaCl 10. 0 g，用 950 mL 去 离 子 水 溶 解 后 用 5 mol/L NaOH 调 节 pH 至 7. 0，用 去 离 子 水 定 容 至 1 000 mL，121 ℃ 灭 菌 20 min，冷却至室温，备用。 将胰蛋白胨用含氮量相等的冷榨花生粕蛋白胨 （CPMP）代替（12. 0 g），其他操作步骤相同，制备得 到的培养基称为冷榨花生粕蛋白胨培养基（CPMP 培养基）。将 37 ℃已活化培养 24 h 的枯草芽胞杆菌 菌种斜面全部转移至 100 mL 无菌水中，用玻璃珠分 散均匀，并稀释至 1×10-3，备用；无菌条件下用吸液 管吸取 1. 0 mL 菌液分别接种至 LB 培养基和 CPMP 培养基，装瓶量为 100 mL（250mL 三角瓶），37 ℃培 养 36 h，定期监测培养液 pH 和 600 nm 条件下的吸 光值（A600 nm），以 LB 培养基培养的枯草芽胞杆菌作 为对照，评价 CPMP 培养基对枯草芽胞杆菌增殖的 影响。

2 结果与分析 

通常情况下，蛋白胨的颜 色 一 般 不 能 太 深，否 则 会 影 响 微 生 物 的 生 长 和 繁 殖 ，如果颜色较深，则需要进行脱色处理。研究 者用微生物发酵法发酵热榨花生粕制备花生蛋白胨 时发现，热榨花生粕蛋白胨颜色较深，呈浅棕色 ， 主要是由于花生粕热榨工艺使花生色素浸出较多， 高温条件下的美拉德反应和焦糖化反应也加深了热 榨花生粕的颜色 。在澄清度和沉淀检测项中，冷 榨花生粕蛋白胨与蛋白胨标准品基本一致，均澄清 透明且无沉淀，全部溶解。作为一种重要的微生物 培养生物化学试剂，蛋白胨的澄清透明是首要标准， 因为在微生物培养过程中常需要进行微生物生长情 况的观测，若蛋白胨溶液呈现混浊或有沉淀易导致 观测结果的不准确 ；在 pH 检测项中，冷榨花生粕 蛋白胨与蛋白胨标准品 pH 较为接近，均在 pH 7. 0 左右；碱性沉淀与磷酸盐沉淀均未检测到，能满足微 生物的生长要求。蛋白胨在微生物生长或产物合成中主要是作为 提供氮源的营养基质，因此，含氮量是蛋白胨重要的 质量评价指标。高质量细菌蛋白胨总氮要求达到 14. 5% 以上，植物蛋白胨由于含糖量相对较高，其 总氮应不低于 8. 5% 。对冷榨花生粕蛋白胨进 行了总氮含量测定，结果为（15. 08±0. 49）%，表明 冷榨花生粕的总氮含量较高，有利于促进微生物的 生长，符合高质量生化试剂蛋白胨的质量要求。

3 结论与讨论

参考《微生物培养基的制造与应用》和《中国生 物制品主要原辅材料质控标准》对蛋白胨进行质量 评价，结果显示，冷榨花生粕蛋白胨颜色为浅黄色， 2% 蛋白胨溶液澄清透明，无沉淀，pH 呈中性，无碱 性沉淀与磷酸盐沉淀，含水量为（4. 16±0. 35）%，灰 分 含 量 为（10. 35±1. 03）% ，总 氮 含 量 为（15. 08± 0. 49）%，氮基氮含量为（2. 503±0. 45）%，含糖量为 （2. 63±0. 14）%，不含亚硝酸盐，磷含量为（0. 073± 0. 15）%，NaCl 含量为（0. 86±0. 02）%，符合生化蛋 白胨的质量要求。将冷榨花生粕蛋白胨与胰蛋白胨在枯草芽胞杆菌增殖培养时无显著差异（p>0. 05）。


 

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