产消化酶活性比较-博迅灭菌器使用

茶是由茶树的嫩茎、叶加工而成，茶饮料具有 独特风味和品质，以及抗衰老、抑菌、降 血 脂、减 肥等功效，是世界上除水之外消费最多的饮品。 一般将茶叶分为黑茶、红茶、白茶、绿茶、乌 龙 茶 和黄茶等６大基本茶类，其中黑茶是我国独具特色 茶类之一。普遍认为黑茶分为陕西茯砖 茶、广 西 六堡茶、湖南安华黑茶和普洱茶等，但也有人将云 南普洱茶定义为后发酵茶，属独特种类。黑茶与后 发酵茶的加工均需要多种微生物的参与，以真菌为 主要发酵菌；茯砖茶的加工过程包括筛分、拼配、 汽蒸、渥堆、筑制、发花、干燥和 成 品 包 装 等，经 过复杂工艺制成产品；普洱茶的发酵过程包括养 地、潮水、翻堆、降 堆、干 燥、渥 香、摊 凉 去 火 等 工艺流程加工而成；六堡茶的加工过程主要包括采 叶、摊晾、杀青、揉捻、渥堆、复揉、烘干、筛分、 蒸压、陈化、出仓等流程。鉴于后发酵茶产地不同， 加工工艺不同，不同产地的主要微生物菌群也不相 同，而这些微生物菌群则影响着发酵后茶叶的风味 与品质。

１ 材料与方法

１．１ 供试茶叶

云南普洱茶、广州小青柑、广西六 堡茶、湖南熙茯茶。

１．２ 主要试剂

蛋白酶 Ｋ 购自 ＭｅｒｃｋＫＧａＡ 公司， 琼脂糖购自法国 ＢＩＯＷＥＳＴ 公司，ＧｏｌｄｖｉｅｗⅡ购自 上海翊圣生物科技有限公司，氯仿购自北京化工厂， 琼脂、Ｔｒｉｓ平 衡 酚、ＴｒｉｓＢａｓｅ （三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷）、ＥＤＴＡ （乙二胺四乙酸）、ＳＤＳ （十二烷基硫酸 钠）、氯霉素、虎红钠盐、酪蛋白、台盼蓝和刚果红购自北京索来宝科技有限公司，氯化钠 （分析纯）、 无水乙醇 （分析纯）、葡 萄 糖 （分 析 纯）、可 溶 性 淀 粉和溴甲酚紫购自天津市凯通化学试剂有限公司， 羧甲基纤维素钠购自青州市清泉纤维素厂，橄榄油 购自辽宁晟麦实业股份有限公司，聚乙烯醇购自上 海源叶生物科技有限公司。用于真菌分子鉴定的扩 增引物由华大基因合成，引物序列为ＩＴＳ１ （５′－ＴＣ－ ＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ４ （５′－ＴＣＣ－ ＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）。

１．３ 主要仪器

生物安全柜，苏州安泰空气技术有 限公司；光照培养箱，上海新苗医疗器械制造有限 公司；ＰＣＲ 扩 增 仪，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公 司；水 平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；培清 ＪＳ－６８０ＤＪ全自动凝胶成像分析仪，上海培清科技有 限公司；ＹＸＱ－ＬＳ－立式压力 蒸 汽 灭 菌 器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高精度数显恒温水浴锅， 常州智博瑞仪器制造有限公司；ＨＮＹ－２１０２Ｃ 摇床， 天津市欧诺仪器仪表有限公司。

１．４ 实验方法

１．４．１ 培养基 （液）的配制

孟加拉红培养基：蛋 白胨５ｇ，葡 萄 糖 １０ｇ，磷 酸 二 氢 钾 １ｇ，硫 酸 镁 ０．５ｇ，琼脂２０ｇ，１／３０００ 孟 加 拉 红 溶 液 １００ ｍＬ， 氯霉 素 ０．５ ｇ， 加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 １０００ ｍＬ， １２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ，备用。ＰＤＡ 培养基：称取 新鲜马铃薯２００ｇ，加热煮沸，煮至土豆软，过滤取 滤液，加入葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，加入ｄｄＨ２Ｏ 定 容至 １０００ ｍＬ，１２１ ℃ 高 压 灭 菌 ２０ ｍｉｎ，备 用。 ＰＤＡ 培养 液：称 取 新 鲜 马 铃 薯 ２００ｇ，加 热 煮 沸， 煮 至 土 豆 软， 过 滤 取 滤 液， 葡 萄 糖 ２０ ｇ， 加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定容至１０００ｍＬ，取１００ｍＬ三角瓶进行分 装，１２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ，备用。产淀 粉 筛 选 培 养基 （２００ ｍＬ 溶 液）： 在 ＮＡ 培 养 基 的 基 础 上，加入０．４ｇ 可 溶 性 淀 粉 和 ０．００５％ 的 台 盼 蓝，加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ２００ ｍＬ，加 入 ＮａＯＨ 调 节 ｐＨ 至 ７．０～７．５，１２１ ℃高 压 灭 菌２０ｍｉｎ后 冷 却 至６０ ℃ 左右，在超净工作台中，分装至直径９ｃｍ 的无菌培 养皿中，冷却凝固后４ ℃贮存，备用。产蛋白酶筛 选培养基 （２００ ｍＬ 溶 液）：称 取 酪 蛋 白 ４ｇ，琼 脂 ３．４ｇ，加入ｄｄＨ２Ｏ 定容至２００ｍＬ，加入 ＮａＯＨ 调 节ｐＨ 至７．０～７．５，１２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ后冷却 至６０ ℃左右，在超 净 工 作 台 中，分 装 到 直 径９ｃｍ 的无菌培养皿中，冷却凝固后４ ℃贮存，备用。产 纤维素酶筛选培养基 （２００ｍＬ 溶液）：称取羧甲基 纤维素钠１．０ｇ，硫酸铵０．４ｇ，磷酸二氢钠０．２ｇ， 硝酸钾０．２ｇ，酵母膏０．１ｇ，七水合硫酸镁０．１ｇ， 蛋白胨 ０．１ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，刚 果 红 ０．０４ｇ，加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ２００ ｍＬ，加 入 ＮａＯＨ 调 节 ｐＨ 至 ７．０～７．５，１２１ ℃高 压 灭 菌２０ｍｉｎ后 冷 却 至６０ ℃ 左右，在超净工作台中，分装到直径９ｃｍ 的无菌培 养皿中，冷却凝固后４ ℃贮存，备用。产脂肪酶筛 选培 养 基 （２００ ｍＬ 溶 液）：在 ＮＡ 培 养 基 中 加 入 １２％橄榄油乳化液、０．００５％溴甲酚紫，调节ｐＨ 至 ８．０，１２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ后冷 却 至６０ ℃左 右， 在超净工作台中，分装到直径９ｃｍ 的无菌培养皿中， 冷却凝固后４ ℃贮存，备用。橄榄油乳化液的配制： 橄榄油和０．０２ｇ／ｍＬ的聚乙烯醇 （ＰＶＡ）以 体 积 比 １∶３混合，６０Ｈｚ震荡混匀５～１０ｍｉｎ，得乳化液。

１．４．２ 真 菌 ＤＮＡ 提 取 液 的 配 制

１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ （ｐＨ＝８．０）１０ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ （ｐＨ＝ ８．０）２０ ｍＬ，２０％ ＳＤＳ ２０ ｍＬ，５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ２０ｍＬ，ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ２００ ｍＬ，调 节 ｐＨ 至 ８．０， １２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ后，常温贮存。

２ 结 果

真菌在 ＰＤＡ 培 养基上进行培养，直至分纯。在云南普洱茶中分离 出２种 真 菌，Ｐ１ 为 篮 状 菌 属 （Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）， Ｐ２为 篮 状 菌 （Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）；在 广 州 小 青 柑 中 分 离出３ 种 真 菌，Ｑ１ 为 阿 曲 霉 （Ａ．ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）， Ｑ２为烟 曲 霉 （Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ），Ｑ３ 为 绳 状 篮 状 菌 （Ｔ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ）；在 广 西 六 堡 茶 中 分 离 出 ２ 种 真 菌，Ｌ１为黑曲霉 （Ａ．ｎｉｇｅｒ），Ｌ２为冠突曲霉 （Ａ． ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）；在湖南 熙 茯 茶 中 分 离 出 １ 种 真 菌，Ｘ１ 为谢瓦曲霉 （Ａ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）。其中，分 离 自 普 洱 茶 的 篮 状 菌 属 Ｔａｌａｒｏ－ ｍｙｃｅｓ．ｓｐ．产纤维酶活性能力最强，分离自 小 青 柑 的绳状篮状菌的产纤维酶活性能力次之 。 ２．４．３ 发酵茶中真菌产淀粉酶活性比较 在发酵茶 分离得到的真菌中产淀粉酶共５种，分别为普洱茶 中分 离 到 的 Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．和 Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ，小 青柑中分离到的烟曲霉和绳状篮状菌以及六堡茶中 分离到的冠突曲霉，统计学分析表明，不同真菌的 产淀粉酶活性差异有统计学意义 （Ｆ＝３６．６０２，Ｐ＜ ０．０１）。其 中，普 洱 茶 中 分 离 到 的 篮 状 菌 Ｔａｌａｒｏ－ ｍｙｃｅｓｓｐ．和小青柑中分离到的绳状篮状菌产淀粉酶 能力最强，普洱茶中分离到的 Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ产淀粉 酶活性能力次之，六堡茶中分离到的冠突曲霉产淀 粉酶能力最差。

３ 讨 论

所用茶叶 中，普洱茶和小青柑属普洱茶系，六堡茶和茯砖茶 属黑茶系，但均可归属于后发酵茶。已有研究表明， 后发酵茶中的优势菌群为真菌，而又以曲霉属、酵 母、青霉属、根霉、毛霉属和冠突散囊菌等为主， 不同茶叶发酵工艺中的真菌菌群，可能是影响发酵 茶口感和品质的主要因素。普洱茶、六堡茶和茯砖 茶是发酵茶的典型代表，而在不同茶叶的发酵过 程中，其优势微生物菌群也有不同，参与普洱茶发 酵的微生物主要以黑曲霉 为 主， 还 包 括 酵 母 （Ｙｅａｓｔ）、 青 霉 属 （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、 根 霉 （Ｒｈｉｚｏ－ ｐｕｓ）、毛 霉 属 （Ｍｕｃｏｒ）等 真 菌；茯 砖 茶 中 优 势 菌群主要以冠突散 囊 菌 （Ｅｕｒｏｔｉｕｍｃｒｉｓｔａｔｕｍ） 为 主；六堡茶 中 优 势 菌 群 为 青 霉 属 和 曲 霉 属 真 菌； 其他发酵茶的优势微生物以曲霉属和散囊菌属等真 菌为主。泾 阳 茯 砖 茶 中 的 优 势 菌 种 为 冠 突 散 囊 菌，其发酵液具有抗氧化活性，且以产总超氧化物 歧化酶 Ｔ－ＳＯＤ 为 主。茶叶中的真菌在发酵过程 中，还可以茶叶为基质产生多酚氧化酶、单宁酶和 纤维素酶等多种酶类。然而，不同发酵茶的 优 势真菌比较及其在发酵过程中是否有产消化酶活性 的研究尚未见报道。