猪肉水饺的非洲猪瘟病毒检测-SSW-600-2S使用

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV） 引起的一种急性、烈性猪传染病，发病率、致死率 可高达 100%，危害严重，对养猪业可造成毁灭性 打击，可引起巨大的经济损失和社会影响。ASF 自 2018 年 8 月在辽宁省首发以来，已在我国多个 省份发生。为进一步加强 ASF 防控，新疆地区 加强临床监视、现场排查，对生猪从生产到屠宰全 程进行采样监测，严格控制生猪及其产品调运监管， 多部门协调联动，形成了良好的工作机制。

1　材料

1.1　样品

样品来源：动物公路检查站拦截的速冻猪肉 馅水饺，其中来源于 A 厂 13 个批次、B 厂 1 个批次； 在冷库、超市中抽检 B 厂速冻猪肉馅水饺 11 个批 次。样品的采集、保存和运输严格按照《非洲猪瘟 监测样品采集、保存与运输方法》中的要求，以 猪肉产品的批次为采样单位，每批次按猪肉产品包 装的规格（件 / 箱）随机抽样。数量为每批次随机 抽取 10 件（箱），每件（箱）采集样品 2 份，合 计每批次采集样品 20 份。

1.2　试剂

天根磁珠法病毒 DNA/RNA 提取试剂盒（批号 S7327）、DNA 病毒反应液（批号 20181129）： 购自北京世纪元亨动物防疫技术公司；TaqMan 探针、ASFV 特异性引物、提取阳性对照、反应阳性 对照：均由中国动物卫生流行病学中心提供。

1.3　仪器设备

上海博讯电热恒温水槽 SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量组织研磨仪、Sigma3K-15 台式冷冻高速离心机、天隆 NP968 自动核酸提取 仪、QuantStudio5 实时荧光定量 PCR 仪。

2　方法

2.1　样品处理

每批次每袋随机挑取 2~3 个饺子，挑出其中 的猪肉进行剪碎。在加有陶珠的组织研磨管中， 加入 1 mL PBS 缓冲液，再加入剪碎的样品约 100 mg，使用 Bertin Precellys 组织研磨仪进行匀 浆处理。处理后放入 60 ℃水浴锅灭活 30 min，每 间隔 5 min 颠倒混匀样品 1 次。

2.2　病毒 DNA 提取

对灭活后的样品 4 ℃ 2 000 r/min，离心 10 min； 取 200 μL 上清液，使用磁珠法病毒 DNA 提取试 剂盒提取 DNA；将提取的核酸于 −20 ℃冰箱中保 存备用。

2.3　荧光定量

PCR 采 用 ASFV 特异荧光定量 PCR 方法扩增 ASFV VP72 基因片段 。PCR 以 20 μL 体系进行： DNA 病毒荧光反应液 10 μL、ROX 0.2 μL、无菌无 核酸水 5.7 μL、正向引物 0.8 μL、反向引物 0.8 μL、 TaqMan 探针 0.5 μL，模板 DNA 2 μL。同时，设立 提取阳性 / 阴性对照、反应阳性 / 阴性对照。密封 反应试管，瞬时离心，放入荧光 PCR 仪，按照荧 光 PCR 循环条件扩增。

3　结果

根据 ASFV 检测操作规程分析，样品 Ct 值低 于 40 为阳性。12 月 5 日检测的 13 个批次样品中， 有 5 个批次检测到 ASFV 特异性扩增曲线，Ct 值 为 28.3~32.68（图 1），其他批次荧光定量 PCR 检 测结果见表 2。



4　讨论

4.1　阳性猪肉产品的处置

新疆畜牧兽医局接到中国动物卫生流行病学 中心的复核确诊后立即行动，要求动物卫生监督部 门会同食品药品监管部门按照应急预案开展处置工 作，销毁阳性样品，并通知各级食品药品监管部门、 畜牧兽医等部门，对同批次产品进行无害化处理， 对相关场所进行彻底清洗消毒，同时继续加强开展 ASF 疫情排查工作。

4.2　加强流调溯源

本次速冻猪肉水饺中 ASFV 核酸的确诊在 国内是首次，能从猪肉产品中检出 ASFV，说明ASFV 已形成了一定污染面。此次在速冻猪肉水饺 中检出 ASFV 核酸，推断是由于潜伏期带毒猪没 有临床症状，屠宰后进入加工企业，被加工生产成 猪肉制品所造成的 。ASFV 自身较脆弱，对热抵 抗力不强。虽然此类猪肉制品一般直接进入餐桌， 在蒸煮烹饪过程，均能将病毒杀死，但是水饺中猪 肉的溯源应引起主管部门的高度重视，这也是控制 疫病传播风险的重要环节。水饺在烹饪过程中，如 果未对猪肉进行高温处理，未煮熟的水饺会以餐厨 垃圾喂猪或进入养殖户，很容易造成 ASFV 的传播扩散 。其次如果在加工处理车间，人员、车辆、 污水、废弃物处理不当，就有可能造成病毒扩散， 从而引发新的疫情 。因此，要加强产地检疫和屠 宰场的实验室检测，及时发现发病猪和处于潜伏期 的猪，防止问题猪肉流入食品生产环节。

4.3　继续做好 ASF 防控

目前国内 ASF 疫情仍呈点状散发态势，因猪 肉制品调入而传播 ASF 的风险较高，因此应该警 惕通过污染病毒的猪肉制品而引发疫情的可能。 鉴于目前 ASF 防控形势仍较严峻，今后仍需重点 排查养殖场、生猪交易市场、屠宰场等高风险场 点，同时加大公路检查站对跨省入疆生猪和猪肉 产品的检查和查处力度，严格控制从疫区调入生 猪及相关产品。