蛴螬对激光损伤兔血分析-博迅恒温水槽使用

眼的血 － 视网膜屏障( Blood － retinal barrier，BＲB) 包 括内屏障和外屏障。内屏障由血管内皮细胞之间的紧密连 接( 如粘连小带和闭锁小带) 以及内皮细胞中少量的囊泡 构成; 外屏障由视网膜色素上皮细胞( Ｒetinal pigment epithelium，ＲPE) 之间的紧密连接和色素上皮调节媒介运输的 不对称分布的蛋白质构成。由于众所周知的激光特性 与眼组织结构特点的相互作用，在医疗上，眼科是第一个应 用激光作为治疗手段的学科。

1 实验材料

1． 1 实验动物

成年健康有色家兔 30 只，体质量 2． 0 ～ 2． 5 kg，雌雄不 限，由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号: 医动字第 20 － 003 号。

1． 2 药品及试剂

1． 2． 1 主要药物

蛴螬酸性水解液制取方法: 蛴螬 400 g ( 湖南东润联合医药有限公司中药材部) ，清洗 10 遍以上， 浸泡 1 晚，后洗至无臭味。加蒸馏水 5 kg，加 37% HCl 至 pH 值为 2。高压蒸汽锅( 哈尔滨松花江医疗器械厂) 蒸 2 h。纱布( 4 ～ 5 层) 过滤，溶液中加 40% NaOH 至 pH 值为 6． 5 ～ 6． 8。冷却，隔水加热，浓缩至 1600 mL( 1 mL 溶液 = 0． 25 g 生药) 。装瓶，压盖，蒸汽高温灭菌，冷藏保存。

1． 2． 2 主要试剂

P75NTＲ 一抗( 武汉博士德生物工程有 限公司) 、TrkA 一抗( 武汉博士德生物工程有限公司) 、DAB 显色试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司) 。

1． 3 主要仪器及器械

眼科手术显微镜( 苏州医疗器械有限公司) 、眼底接触 镜( 苏州医疗器械有限公司) 、YZ/3 三面镜( 苏州医疗器械 有限公司) 、YZ5F 裂隙灯照相机( 苏州医疗器械有限公 司) 、裂隙灯显微镜( 苏州医疗器械有限公司) 、AG204 型电 子天平( 上海梅特勒—托利多仪器有限公司) 、TD5 － Ⅱ台 式离心机( 长沙平凡仪器仪表有限公司) 、SSW 型电热恒温 水槽( 上海博迅实业有限公司) 、721 分光光度计( 上海第三 仪器厂) 、LKB8800 超薄切片机( 瑞典 LKB 公司) 、多功能显 微镜( 西德 OPTON 公司) 、Olympus 光学显微镜( 日本日立 公司) 、石蜡包埋机( 日本日立公司) 、LeicaMPS30 照相系统 ( 德国 Leica 公司) 、Leica 石蜡切片机( 德国 Leica 公司) 、莱特 532 眼底激光治疗仪( 法国光太公司) 。

2 实验方法

2． 1 激光损伤血 － 视网膜屏障动物模型的建立

参照王晓英、陈少军等造模方法并加以改进。实 验动物的准备: 激光照射当日用复方托吡卡胺眼药水滴眼 2 次。

2． 2 造模方法

兔称重，固定，20% 乌拉坦 1 g /kg 耳缘静脉注射全麻， 将兔头部固定于激光机前，三面镜置于结膜囊内，以波长 532 nm 的倍频 Nd: YAG 激光( 光斑直径 50 μm，能量 110 mw，曝光时间 0． 15 s) 在视盘及有髓神经纤维下视网膜处 密集照射 40 个点，光斑紧邻，最大间隔为 100 μm。光斑效 应为 3 级( 中度 ～ 重度) : 中心白较浓或更浓，激光能量作用于内核层。

2． 3 动物分组及给药方法

30 只成年健康有色家兔随机抽取 10 只( 20 只眼) 作 为正常组，其余 240 只( 40 只眼) 造成激光损伤血 － 视网膜 屏障模型，并随机分成模型组、蛴螬组，每组 10 只( 20 只 眼) 。 造模后第 2 天开始给药，正常组与模型组予 0． 9% 生 理盐水灌胃，5 mL/kg，1 次/d; 蛴螬组予蛴螬提取液灌胃，5 mL/kg，均为 1 次/d( 相当于成人等效最大剂量) 。

2． 4 标本采集方法

连续灌胃 1 周后，各组随机抽取 5 只兔进行标本的采 集和指标的检测，各组剩余的兔继续同法灌胃至第 2 周结 束，再行标本的采集和指标的检测。

2． 4． 1 眼球壁标本的采集

实验结束后，动物耳缘静脉注 射空气处死，立即沿角膜缘作标记后摘除眼球，生理盐水冲 洗干净，在冰生理盐水中于角膜缘后 0． 5 mm 处剪开眼球 壁，去除眼前节组织和玻璃体，在手术显微镜下找到激光斑 所处视网膜，大于激光斑范围约 3 mm 切除该处眼球壁，用 4% 多聚甲醛在 4 ℃固定。

2． 4． 2 视网膜组织匀浆的采集制作

将依同法摘除的眼 球壁在手术显微镜下剥离激光斑部位视网膜，用滤纸吸干 水分，电子天平称其湿重，再用双蒸水按照湿重∶ 体积 = 1 ∶ 19 配制成 5% 的视网膜匀浆液。

2． 5 观测指标及其方法

2． 5． 1 眼底观察及照相

造模后即刻作眼底照相; 每日灌 胃前用直接检眼镜查看眼底，观察眼底情况，光凝后 7 d、14 d 再次眼底照相。

2． 5． 2 光镜下 HE 染色观察

将已经 4% 多聚甲醛固定 12 h 的眼球壁修片，切取激光斑部位视网膜( 正常组切取 相应部位) ，再置于新的 4% 多聚甲醛固定液继续固定，梯 度酒精脱水，石蜡包埋，切片，经苏木素伊红染色( HE) ，封 片后镜检，显微摄影。

2． 5． 3 神经营养因子受体蛋白( TrkA、p75NTＲ) 表达的免疫组化观察

采用 S － P 免疫组化法检测视网膜组织的 TrkA、p75NTＲ 表达: 石蜡切片经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇 脱水后切片，3% H2O2 去离子水孵育 5 ～ 10 min，阻断内源 性过氧化酶，根据需要对组织切片进行预处理，滴加兔来源 的一抗，37 ℃ 孵育 1 ～ 2 h，PBS 冲洗，2 min × 3 次，滴加山羊抗兔 IgG 抗体 － HＲP 多聚体，37 ℃孵育 20 ～ 30 min，PBS 冲洗，2 min × 3 次，选用 DAB 显色，蒸馏水充分冲洗，选择 适当的 封 片 剂 进 行 封 片。阴 性 对 照 省 去 滴 加 TrkA、 p75NTＲ、一抗的步骤，阳性结果为棕黄色。用 HAIPS － 1000 高清晰彩色病理图像测量系统计算面密度值( 目标面 积/统计场面积) 作为半定量参数，测量 TrkA、p75NTＲ 的表 达。

2． 6 统计学方法

所有实验数据以均数 ± 标准差( 珋x ± s) 表示，用 SPSS 12． 0 进行统计学处理。先做方差齐性检验，方差齐者用单 因素方差分析及 LSD 多重比较。方差不齐者作 Tambane’ sT2 检验。

3 结果

造模后各组均有明显激光斑，某些见出血灶，激光斑中 心颜色呈浓白色，周边见浅色一圈光晕。7 d 后，蛴螬组激 光斑颜色变淡，中心见色素形成，且边界清楚，可见少许玻 璃体混浊。14 d 后，蛴螬组激光斑部分转化为瘢痕组织，范 围较前明显缩小。正常组: 视网膜组织结构 完整，层次清楚，细胞排列整齐。光感受器细胞内外节无变 性，内外核层细胞数目多，内外网状层无水肿，神经节细胞 数目多无空泡样变性，细胞数目多。

4 讨论

中医认为: 激光致血 － 视网膜屏障损伤主要是由于热 灼阴津、热灼血络，气津相关，气能生津、化津、摄津，津能载 气，若阴津亏耗，无以载气，则气失依附而气散气耗而致气 虚; 气生于精，精化为气，阴精亏耗必致气虚; 阴损耗气而致 气阴两虚，气为血帅，气行血行，若气虚运血无力，可致气虚 血瘀。最终导致视网膜细胞的水肿、渗出、出血甚至坏死， 故治疗常以益气养阴、活血利水为原则。