活菌数的变化规律研究-博迅生化培养箱使用

枸杞是我国传统的药食同源性中药药材，性甘味平， 滋补肝肾、益精明目。枸杞原浆经乳酸菌发酵不仅会产 生丰富愉悦的风味而让消费者更易接受，同时乳酸发酵带 来的益生作用也提高了枸杞的药用保健价值，为枸杞类饮 品市场扩展了更大的开发空间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞（市售宁夏中宁枸杞）；植物乳杆菌 360（Lactobacillus plantarum），四川高福记生物科技有限公司；无 水葡萄糖（食品级原料），山东保龄宝生物股份有限公司； D- 无水葡萄糖（标准品），中国药品生物制品检定所；硫 酸、苯酚、95% 乙醇、NaCl、MRS 固体培养基成分等试剂， 均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HM-928 料理机，广州黑马电器有限公司；电子天平， 梅特勒 - 托利多仪器（上海）有限公司；HH-4 水浴锅，常 州国华电器有限公司；TD5M 台式低速离心机，长沙湘智离 心机仪器有限公司；UV-1800 紫外 - 可见分光光度计， SHIMADZU CORPORATION；立式压力蒸汽灭菌器，上海申 安医疗器械厂；超净工作台，济南鑫贝西生物技术有限公司； 恒温生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；320 pH Meter，METTLER TOLEDO 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵工艺

1.3.1.1 工艺流程

干枸杞→料液比 1:6 →浸提→打浆（添加 5% 葡萄糖） →灭菌（105℃、15min）→冷却、接种（万分之八）→发 酵（37℃、40h）→成品→去籽、调配饮料。

1.3.1.2 工艺要点

原料处理：挑取颗粒均匀、饱满的枸杞干果，用水冲洗 两次以去除表面的杂质、灰尘等。 浸泡：以料水比 1:6 的比例，用温水（40~50 ℃）浸泡 枸杞至变软。 打浆：将浸泡后的枸杞料液加入 5% 葡萄糖一起进行打 浆、破碎。 灭菌：在 105℃下灭菌 15min，灭菌时间不能过长，否 则会破坏枸杞的色泽。 冷却：采用自来水及时分段冷却。 接种：采用植物乳杆菌菌剂进行直投式接种，接种量为原浆重量的万分之八，将称好的菌剂溶于少量无菌水后投入 原浆中。 发酵：在 37℃下发酵 40h，定期取样。

1.3.2 pH 值测定

采用 pH 计进行测定，每隔 4h 取样。 1.3.3 多糖测定 采用苯酚 - 硫酸法进行测定，每隔 8h 取样。

1.3.3.1 对照品制备

葡萄糖（0.1mg/mL）：准确称取无水葡萄糖标准品 25mg，溶解后置于250mL 容量瓶中定容。

1.3.3.2 标准曲线绘制

取标准溶液 0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL 至具塞试管， 分别加水定容至 2.0mL，然后加 1mL5% 苯酚溶液，摇匀后 加入 5mL 浓硫酸（H2SO4）摇匀，静置 10min。将具塞试 管放入水浴锅（40℃）保温 15min，迅速冷却至室温，放 置 20min 后在 490nm 下进行紫外吸光度的测定。

1.3.3.3 供试样品制备

取 50mL 发酵前后的原浆离心，取上清液 3mL，加 入 30mL95% 乙 醇， 醇 沉 20min 后 离 心，4000r/min 离 心 20min；弃去上清液，用 85% 乙醇进行洗涤，最后加水 定容至 25mL；取 200μL 样品测定吸光度。

1.3.3.4 样品多糖测定

取 200 μL 样品溶液至具塞试管，分别加水定容至 2.0mL，加 5% 苯 酚 溶 液 1mL， 摇 匀 后 加 入 浓 硫 酸 （ H2S O4）5mL 再次摇匀，静置 10min；将具塞试管放 入水浴锅（40℃）保温 15min，迅速冷却至室温，放置 20min；在 490nm 下进行紫外吸光度的测定。

1.3.4 活菌数测定

采用平板（MRS 固体培养基）稀释法，每隔 4h 取样。

1.3.4.1 样品处理

取发酵枸杞原浆 1mL，加入至 9mL 无菌生理盐水 中，稀释度为 10-1 样液，按此方法依次将枸杞原浆稀释到 10-6、10-7 样液备用。

1.3.4.2 乳酸菌计数

取 稀 释 度 为 10-6、10-7 发 酵 枸 杞 原 浆 1000μL 菌 液 涂 布 MRS 固体培养基上，然后置于 37℃恒温培养箱中培养 48h，并记录单菌落数，同时计算出活菌数。

2 结果与讨论

在整个发酵过程中，发酵原浆的整体 pH 值呈下 降趋势——起始 pH 值为 4.92，在 0~8h 之间下降不 明 显 ，8 ~ 1 6 h 之 间 下 降 幅 度 最 大 ，1 6 h 之 后 趋 于 平 缓 ， 发酵终点时 pH 值达到 3.58。究其缘由，主要是因为 枸杞原浆中的植物乳杆菌利用自身的酶类物质、通过 EMP 途径降解了枸杞原浆中的碳水化合物（如葡萄 糖），进而发酵产生了大量有机酸（以乳酸为主）， 增加了发酵原浆的酸度，降低了 pH 值。到终点时 pH 值得变化趋于平缓，主要是由于乳酸菌进入衰亡期， 产生的酸有所减少。植物乳杆菌的活菌数在发酵过程中的动态变化如，活菌数随发酵时间的增加先升高后降低，生长趋势 与束文秀等研究中乳酸菌的生长趋势一致。在 0~16h 植物乳杆菌的生长速度较快，呈现上升趋势；4h 之 前缓慢增长，在 12h 时接近达到了最高点，活菌数为 6.84×10 9 cfu/mL；12~28h 时生长平缓，处于稳定 期；28h 之后下降明显。究其缘由，主要是由于发酵 原浆中碳源等营养物质的减少和代谢产物尤其是酸的 产生影响了乳酸菌的生长。整个发酵过程中，活菌数 均处于 10 8 cfu/mL 以上，说明枸杞对植物乳杆菌的 生长有促进作用。

3 结论与讨论

考察了枸杞原浆在发酵过程中 pH 值、枸杞多糖 和活菌数的变化规律。结果表明，发酵过程中，pH 值和枸杞 图 2 枸杞原浆在发酵过程中的枸杞多糖变化 多糖呈现下降趋势，活菌数先上升后下降，最终 pH 值达到3.58、枸杞多糖含量达 1271.78mg/L、植物乳杆菌活菌数达 2.57×109 cfu/mL。如果将发酵好的枸杞原浆稀释 100 倍调配 成枸杞饮料，其活菌数仍可达到≥ 106 cfu/mL 的乳酸菌活菌 饮品标准。