博迅对抑制表皮葡萄球菌生物被膜的实验研究

目前，随着临床插管、心脏支架、人工关节等医 疗器材的广泛使用，因此而带来的细菌生物被膜感 染也越来越多。然而，生物被膜的抵抗作用使抗生 素难以杀死膜内细菌，治疗此类感染需要大剂量的 抗生素，从而极易导致细菌产生广泛的耐药性，为临 床治疗带来困难。最终，临床治疗时只能通过更换 留置物来彻底解决此类困惑，以至于给患者造成巨 大的身心创伤及高昂的医疗费用。为此，本研究以 表皮葡萄球菌生物被膜模型为研究对象，采用试管 二倍稀释法，进行体外抑菌活性实验，观察大蒜素联 用后在抑制生物被膜生长及其相关基因 icaA 表达 的变化，研究中药的抑菌作用，探讨降低临床细菌耐 药率的新途径。

1 材料

1． 1 实验菌株

由江西中医药大学附属医院中医 外科住院患者伤口分泌物中分离得来。

1． 2 主要试剂及仪器

大蒜素注射液( 江苏正大 天晴) ; 盐酸环丙沙星注射液( 广东环球制药) ; 营养 肉汤培养基( 杭州天和) ; 普通细菌培养箱( 上海跃 进) 、全自动细菌鉴定和药敏分析仪器 WalkAway － 96 ( SIEMENS，Germany ) 、二氧化碳细菌培养箱 ( SANYO，JAPAN) 、酶标仪( 北京普朗) 、QT － PCR 仪( ABI，美国) 、生物安全柜( 上海博迅医疗股份有限公司) 。

2 方法

2． 1 制备菌液制备

0． 5 麦氏度( 1． 5 × 108 CFU / mL) 的细菌菌液，再稀释 15 倍，将浓度调为 1． 0 × 107 CFU /mL，于 4℃保存备用。

2． 2 试管二倍稀释法

将抗菌药进行梯度二倍稀 释后接种检测菌，37℃孵育 24h 后，将肉眼可见的细 菌生物被膜孔的最低药物浓度定为药物的最低抑菌 浓度。分五组进行: A 大蒜素组，准备 10 支无菌试 管，加入大蒜素，从浓度 900μg /mL 开始对倍稀释， 后分别加 50μL 表皮葡萄球菌菌液，使终液浓度为 5 × 105 CFU /mL; B 环丙沙星组，准备 10 支无菌试 管，加环丙沙星，从浓度 100μg /mL 开始对倍稀释， 后分别加 50μL 表皮葡萄球菌菌液，使终浓度约为 5 × 105 CFU /mL; C 大蒜素 + 环丙沙星组，取 10 支试 管，加入大蒜素，从浓度 900μg /mL 开始对倍稀释， 后分别加 50μL 表皮葡萄球菌菌液，使终浓度为 5 × 105 CFU /mL，37℃培养 6h 后，加入环丙沙星，使 1 ～ 10 试管浓度为 100 ～ 0． 195μg /mL 10 个梯度; D 阴 性对照组只加肉汤; E 阳性对照组只加肉汤及菌液;37℃培养 24h 后，观察记录各组 MIC 值。

2． 3 药物抑制细菌被膜的观察

分 A 环丙沙星 组、B 大蒜素 + 环丙沙星组; 取 96 孔板，每孔总量 200μL，菌液终浓度 5 × 105 CFU /mL，37℃ 孵箱培养 24h 后，加入药物组，其浓度按 1． 3． 2 所得的 MIC 进 行，继续培养 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，取相 应时间点实验孔进行结晶紫染色，于 595nm 处测各 自 OD 值。

2． 4 药物处理

QT － PCR 检测基因 icaA、agr 的 表达 分 A 环丙沙星组、B 大蒜素 + 环丙沙星组; 每 孔总量 200μL，菌液终浓度 5 × 105 CFU /mL，37℃ 孵 箱培养 24h 后，加入药物组，其浓度按" 1． 3． 2" 项下 所得的 MIC 进行，继续培养 48h 后超声震荡取菌， 利用 QT － PCR 检测生物被膜相关基因 icaA 的表达 变化。

2． 5 统计分析

应用 SPSS 20． 0 统计软件，将所得 数据进行分析，符合正态分布且方差齐性的计量资 料，用均数及标准差描述，根据设计类型采用相应的 t 检验; 如不符合用四分位数和中位数描述，根据设 计类型采用相应秩和检验，P ＜ 0． 05 有统计学意 义。

3 结果

单用抑制表皮葡萄球菌被膜时，MIC大蒜素 为( 28． 125 ± 3． 12) μg /mL，MIC环丙沙星 为( 3． 125 ± 0． 23) μg /mL; 两者联用时，MIC大蒜素、MIC环丙沙星 分别 为( 14． 063 ± 2． 30) μg /mL、( 1． 563 ± 0． 09) μg / mL，两数据采用 t 检验分析后发现联用前后 MIC 有 显著差异( P ＜ 0． 05) ，且明显降低。

在两组药物抑制 细菌被膜在 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h 时间点 结晶紫染色后，于 595nm 处测定 OD 值。两组药物抑制细菌被膜在 48h 后超声震荡取菌， 利用 QT － PCR 检测生物被膜相关基因 icaA 的表达 量变化。

4 讨论

当今，随着临床插管、心脏支架、人工关节等医 疗器械的广泛使用，由此带来的细菌生物被膜 ( bacterial biofilm，BBF) 的感染也越来越多。BBF 是指细菌附于惰性材料后，繁殖、分化，并分泌多糖 基质将菌体包裹于其中克隆聚集缠绕形成的细菌聚 集体膜状物，它通过产生细胞间脂多糖，保护细 菌不受抗菌药物的抑制，从而逃避机体免疫，成为潜在感 染 源，最终引发感染的反复发作且难以控制。由此，BBF 的抵抗作用使抗菌药物难以到 达膜内杀死细菌，导致临床治疗需要大剂量抗生素， 从而容易引起细菌产生广泛的耐药性，为治疗带 来严重的困难。最终，临床上对此不得不更换留 置物来彻底解决此类问题，给患者带来身心剧痛及 高昂的医疗费用。目前，表皮葡萄球菌是临床常见 致病菌，也是引起 BBF 的常见细菌，表皮葡萄球 菌生物被膜形成而导致的各系统感染已成为临床感 染难治性的重要类型之一。因此，探索新途径治 疗细菌生物被膜感染具有十分重要的临床医学意义。