蛋白酶介导黑变的结构基础与酶学机制分析

近年来，随着人们生活水平的提高，虾类养殖 与海洋捕捞发展迅猛， 其中南美白对虾已成为世 界三大养殖对虾品种之一，然而由于保鲜技术 仍未能获得实质性突破， 原料在冷藏和运输过程 中的黑变现象十分突出。 黑变对消费者虽然不会 造成安全危害，但是会显著降低产品市场价值。 研 究表明，虾类黑变与微生物作用无关，而与其体内 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活力有关。 基于酶促褐变机理， 目前控制对虾冷藏过程中的 黑变主要通过理化和生物方法，从阶段上讲属 于末端策略， 而对虾黑变是一个极其复杂的级联系统。

1 材料与方法

1.1 试剂

Fura-2/AM 荧光探针，Sigma 公司； 鼠源丝氨酸蛋白酶多克隆抗体， 上海酶联生物科技有限公 司；二氨基联苯胺，西安永屹生物技术有限公司； 甲醛（AR），广州化学试剂厂；冰乙酸（AR），广州化 学试剂厂；无水乙醇（AR），广州化学试剂厂；三氯 甲烷（AR），衡阳市凯信化工股份有限公司；二甲 苯，广东光华科技股份有限公司；苏木精，中国医 药（集团）化学试剂公司；伊红，国药集团化学试剂 有限公司； 中性树胶， 国药集团化学试剂有限公 司。

1.2 仪器

Nikon80i 显微镜，日本尼康公司；MesoMR-60 低场核磁共振仪， 上海纽迈电子科技有限公司； RM2245 半自动转轮切片机，徕卡仪器有限公司； D-37520 冷冻离心机， 上海柏辰生物科技有限公 司；JEM-2100F 场发射透射电子显微镜，日本电子 株式会社；BCD-166TNA 海尔冰箱，青岛海尔股份 有限公司；DHG-9053A 电热鼓风干燥箱， 上海一 恒科学仪 器 有 限 公 司；GZX-9070 数 显 鼓 风 干 燥 箱 ， 上海博讯实业有限公 司医疗设备厂 ； BSA224S 电子分析天平， 赛多利斯科学仪器 （北 京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

体长 12～15 cm 新鲜南美白对 虾购自湛江市霞山水产品批发市场， 充氧保活运 输至实验室，选取色泽良好、肢体外壳完好、大小 一致的个体，置于冰块中猝死，清水冲洗干净后用 筛绢沥干装入保鲜盒中于 4 ℃冰箱冷藏。 在 120 h 储藏期内，每 24 h 采用低场核磁共振对南美白对 虾体内水分分布状态进行测定， 之后取肝胰腺组 织进行组织化学样品制备和观察。

1.3.2 组织化学样品制备与观察

每隔 24 h 取 肝胰腺组织，超净工作台中参照 Li 等试验方法 由代表性部位切取 5 mm×5 mm×2 mm 组 织 块， Bouin’s 固定液中进行组织固定，固定结束后梯度 乙醇脱水，组织透明后石蜡包埋，5 μm 组织切片， 常规染色程序染色后光学显微镜观察拍照。 透射 电镜样品制备与观察在广东医科大学电镜室完 成。

1.3.3 低场核磁共振

采用低 场核磁共振仪对南美白对虾 4 ℃冷藏过程中的水 分状态进行监测， 置于 15 cm 的核磁管中然后放入磁体箱中，质子检测参数为共振频率 23.3MHz， 磁体强度 0.5T±0.05T，线圈直径为 60mm，磁体温 度为 32 ℃，采用 T2 测试（CPMG 序列）程序对弛 豫谱图进行分析，其参数分别为 P90（us）=21.50， P180 （us）=38.48， SW （kHz） =100， D3 （us） =0.1， TR（ms）=5 000，RG1=20， RG2=3， NS=8，TE= 0.4 ms，NECH=12 000； 采用断面扫描程序对在体 水分状态进行质子密度图像扫描。

1.3.4 Ca2+荧光标记与观察

以二 甲基亚砜为溶剂配制 7.5 mmol/L Fura-2/AM 作为 Ca2+负载试剂，分装之后-18 ℃保存，用时将脱水 处理后的石蜡切片滴加 Ca2+负载试剂，加入 0.01% 小牛血清白蛋白协助 Fura-2/AM 负载， 然后加入 5 mmol/L 的 Hepes 液在 4 ℃终止负载，15 000 g 离 心 5 min 后将所得沉淀悬浮 于 3 mL Hepes 液，4 ℃下保存并在 2 h 内进行荧光测定。

1.3.5 丝氨酸蛋白酶免疫组织化学分析

丝氨酸 蛋白酶免疫组织化学参照进行。 组织 标本经常规石蜡包埋、5 μm 切片、二甲苯脱蜡、梯 度乙醇脱水处理后， 进行 0.01 mol/L 柠檬酸缓冲 液（pH=6.0）及微波抗原修复。 室温下将玻片置于 10%山羊血清的湿盒中封闭 20 min， 之后在玻片 上滴加 SP 兔抗人多克隆抗体（1∶100），湿盒中 4 ℃ 冰箱内过夜，第 2 天室温下于玻片上滴加二抗，然 后湿盒内孵育 10 min， 孵育完毕后柠檬酸缓冲液 冲洗玻片并进行二氨基联苯胺显色，苏木精复染， 常规脱水，中性树胶封片后显微观察拍照。

2 结果与分析

随着冷藏时间的延长，肝胰 腺组织中肝小管有不同程度的破裂， 冷藏初期肝 小管结构完整，肝小管之间接触紧密，排列规则， 肝小管内细胞紧贴肝小管内壁， 随着冷藏时间的 延长肝小管逐渐呈现不同程度的破裂， 内壁细胞 也逐渐由肝小管脱落， 冷藏至第 5 天时肝小管完 全失去管状结构，细胞呈弥散状散落。在冷藏初期细胞骨架完整，各种成分区域化分布，然而随着冷 藏的延续细胞骨架逐渐解体， 细胞内各种成分开 始呈随机化分布， 冷藏第 4、5 天时已完全失去刚 性结构，胞内各种组分和细胞器充分接触，使品质 劣变的酶促反应进一步加速，本结果在组织、细胞和亚细胞水平上为对虾冷藏过程中因组织和细胞 骨架结构破损而引起的细胞及其组分的聚集迁移 提供了证据， 证明肝胰腺组织及细胞骨架解体为 SP 介导 ProPO 激活破除了结构障碍。

3 结论

组织化学和低场核磁共振研究表明， 南美白 对虾冷藏过程中肝胰腺细胞结构发生渐进性解 体，自由水含量随之显著增加，在结构解体和自由 水加速向胞外迁移的过程中， 驱动 Ca2+和丝氨酸 蛋白酶由胞内向胞外迁移，激活 ProPO，从而触发和加速黑变进程。