气道炎症的影响分析-上海博迅BXM-30R的应用

感染后咳嗽与气道广泛的炎症密切相关。气道 炎症可由细菌或病毒介导，气道炎症反应时，气道上皮 损伤，炎性细胞活化并浸润于气道，大量细胞因子和炎 性介质产生和释放，使气道壁神经暴露，并使以磷脂形 式存在于细胞膜上的花生四烯酸( AA) 在 PLA2 和 PLC 催化下，从磷脂池中释放出来，在 AA 代谢酶的作 用下转变为具有生物活性的代谢产物，发生 AA 的炎 症级联代谢。本课题组前期进行了射干的药效学 实验研究，结果表明: 射干具有抗炎、止咳、祛痰、增强 机体免疫功能、解热、镇痛、抑菌等药理作用。通 过经典化学方法，对射干进行了分离，获得了具有显著 生理活性的异黄酮类化合物野鸢尾黄素。

1 材料与方法

1. 1 主要药物与试剂

野鸢尾黄素( 100509) 均购于江苏永健医药科技 有限公司。肺宁片购自吉林吉春制药股份有限公司 ( 20140206) ; Hep － 2 人喉表皮癌细胞购自江苏齐氏生 物科技 有 限 公 司; ＲSV 由中科院武汉病毒所赠予; DMEM 培养液和胎牛血清购自 COＲNING 公司; DMSO 购自美国 Sigma 公司; 胰酶和青链霉素购自中国医学 科学院生物工程研究所; BCA 蛋白试剂盒购自 Beyotime 公司( Lot NO: P0012 － 1) ; 显影粉、定影粉，购自 天津市世纪奥博商贸有限公司; protein loading buffer 购于北京全式金生物科技有限公司( Lot NO: 120703) ; T － bet 抗体购于美国 abcam 公司; GATA － 3 抗体购于 武汉博士德生物; 二抗( bs － 0295G － HＲP) 购于 bioss 博奥森。

1. 2 主要仪器

组织匀浆机( MagNA Lyser，瑞士罗氏) ; 喷雾仪 ( EM99 － 002，惠州斯莱达) ; 全自动模块式血液体液分 析( XN － 1000，日本 Sysmex 公司) ; 熏烟箱( 自制) ; 三 气培 养 箱 ( CB210，德 国 Binder) ; 倒置荧光显微镜 ( XDS － 500C，上海蔡康) ; 超净工作台( SW － CJ － 2D， 苏州净化) ; 低速离心机( BY － 400C，北京白洋) ; 立式蒸汽灭菌器( BXM － 30Ｒ，上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ; 微型旋涡混合仪 ( XW － 80A，上海沪西) ; 分析天平( XS105，瑞士 Mettler － Toledo) ; 转印槽( 170 － 390，美国 Bio － Ｒad) ; 电Q，德国默克) 等。 

1. 3 实验动物

SPF 级雄性豚鼠 40 只，体质量 250 ～ 400 g，购自 北京维通利华实验动物技术有限公司，在辽宁省中医 药研究院( 辽宁中医药大学附属第二医院) 动物实验 中心饲养，环境许可证号: SYXK( 辽) 2012 － 0003，湿 度 40% ～ 70% ，温度 20 ～ 26 ℃，自由饮水。

1. 4 实验方法

1. 4. 1 感染后咳嗽模型的建立

SPF 级雄性豚鼠在 SPF 级环境下饲养，空白对照组动物单独饲养，在适应 新的环境 1 周后开始实验，除空白组外，把其他组豚鼠 放入自制体积为450 mm × 450 mm × 900 mm 的烟熏箱 内，5 只一笼，一箱装 6 笼，将 10 支新一品黄山牌香烟 点燃放入 50 g 刨花中产生烟雾，并置于自制烟熏箱 内，每日 1 次，每次持续烟熏 30 min，自由进食、饮水， 连续 7 d，分别于实验的第 2、3 天，用乙醚浅麻醉豚鼠 后，经鼻腔滴入已事先扩增冻存好的滴度为 8 × 106 pfu /mL 的病毒液，滴入体积以体质量 1 μL /g 计算。

1. 4. 2 实验动物分组及给药方法

将 70 只 SPF 级豚 鼠适应性饲养 1 周后，随机分为 7 组，即空白组、模型 组、中药阳性组［肺宁片 512 mg /( kg·d) ］和野鸢尾黄 素组［48 mg /( kg·d) ］，每组 10 只。按“1. 4. 1”制备 感染后咳嗽动物模型，除模型组外，其它各给药组在第 8 天时开始给药，每天 1 次，连续给药 7 d，空白组给予 等体积生理盐水。

1. 4. 3 感染后肺组织

ＲSV 病毒检测 将实验豚鼠以 25 mg /kg 用 2% 戊巴比妥麻醉后，在无菌条件下取模 型组和空白组豚鼠约 100 mg 肺组织，加 PBS 溶液 1 mL 匀浆，匀浆机 6500 r/min，50 s，匀浆两次后，离心机 2000 r/min 离心 10 min，加入链霉素溶液 10 μL，充分 混匀，用移液器仔细吸取上清 100 μL，接种于 Hep － 2 细胞上，在 DMEM 培养基( 含 2% 牛血清) 中生长，每 日仔细观 察 病 变，若 有 特 征 性 病 变 出 现 者，确 定 为 ＲSV 阳性。

2 结果

细胞上培养至第 2 天可见细胞变化，逐渐肿胀、变 圆和聚集，细胞之间的间隙增大，第 4 天逐渐出现多核 巨细胞( 又称融合细胞) ，提示 ＲSV 病毒感染成功 。全自动模块式血液体液分析仪上测定各组豚鼠肺 泡灌洗液中白细胞总数、单核计数、淋巴细胞计数、嗜 酸性粒细胞计数及中性粒细胞计数，结果表明，模型组 肺泡灌洗液中中性粒细胞计数显著高于空白组( P ＜ 0. 01) ，白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒 细胞计数显著高于空白组，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) ，提示模型组豚鼠具有气道炎症。给药后，野鸢 尾黄素对嗜酸性粒细胞有显著抑制作用( P ＜ 0. 05) 。具有祛痰利咽、消癖散结、清热解毒、消肿 止痛的功效，是中医治疗喉痹咽痛之要药。有研究表明射干对炎症早期和晚期均有明显的抑制作用，野鸢尾黄素是射干中的活性成分，但目前 其治疗感染后咳嗽和气道炎症尚无报道。本实验采用 公认的 ＲSV 感染豚鼠的方法复制感染后咳嗽模型，采 用野鸢尾黄素进行治疗，并通过枸橼酸引咳观察其镇 咳作用，采用全自动模块式血液体液分析仪检测检测 肺泡灌洗液中炎性细胞，采用 HE 法观察对肺组织形 态学的影响，采用 ELISA 试剂盒法检测肺泡灌洗液中 细胞因子，采用 Western Blot 法检测 Th1 和 Th2 特异 性转录因子 T － bet 和 GATA － 3 蛋白的表达，揭示射 干不同异黄酮单体化合物抗气道炎症的作用及其机 制。

3 讨论

感染后咳嗽又称为“感冒后咳嗽”，是指呼吸道 感染发热等急性期症状消失后，咳嗽仍迁延不愈，可持 续 3 ～ 8 周的时间，呈喉痒、干咳或咳少量白色黏液痰， 血常规、C 反应蛋白、胸片提示无异常，是呼吸道感染 后常见的并发症。射干，是多年生草本鸢尾科植物 射干［Belamcanda chinensis( L. ) Ｒedouté］之干燥根茎， 最早记载于《神农本草经》。其味苦、辛，性寒，微毒，ＲSV 感染咳嗽模型。