上海博讯培养箱分析细胞增殖的影响

近年来，大豆异黄酮因为其潜在的抗肿瘤生 物活性而受到研究者广泛关注。大豆异黄酮的结 构与内源性雌激素相似，具有弱雌激素效应，被称 为植物雌激素。大豆异黄酮对乳腺癌、前列腺癌 等雌激素依赖性肿瘤的抑制作用已经得到广泛证实。随着研究的深入，研究者发现大豆异黄 酮对非传统意义上的雌激素依赖性肿瘤也有抑制 作用，如大肠癌。

1 材料与方法

1. 1 仪器与试剂

外消旋雌马酚及其对映异构体( 纯度＞99%) 购于 美 国 LC Laboratories 公 司，雌 激 素 受 体 ［estrogen receptor，EＲα ( SC-542 ) ］、EＲβ ( SC8974) 、β-actin ( SC-47778) 和核因子红系 2 相关 因子 2［nuclear factor ( erythroid-derived 2) -like 2， Nrf2］抗体购自美国 Santa Cruz Biotecnology 公司， 二抗抗体购自爱尔兰 Ｒockland 公司，胰酶、胎牛 血清、细胞培养基购于美国 Invitrogen 公司，蛋白 提取、定量及蛋白免疫印迹相关材料试剂购自美 国 Bio-rad 公司，3-( 4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯 基四氮唑溴盐［3-( 4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5- diphenyltetrazolium bromide，MTT］试剂购于美国 Sigma 公司，雌激素受体( estrogen receptor，EＲ) 抑 制 剂 ( ICI182780 ) 、EＲα 激 动 剂 ［1，3，5-tris ( 4-hydroxyphenyl ) -4-propyl-1Hpyrazole，PPT］和 EＲβ 激动剂( diarylpropionitrile，DPN) 购于美国 Sigma 公司。酶联免疫检测仪为美国 Thermo 公 司产品。

1. 2 细胞培养

人大肠癌 HCT15 细胞购自北京协和医学院 基础医学细胞中心，用含 10%胎牛血清的 1640 培 养基，在 5% CO2、37 ℃博讯常温培养箱（上海博讯BPX-272）中培养。 

1. 3 细胞增殖检测

对数生长期的 HCT-15 细胞，胰酶消化后，用 含 10%胎牛血清的培养液配成单细胞悬液，每孔 2 ×103 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 μL。 相同培养条件下培养 24 h 至细胞贴壁。根据前 期研究，加入含 0、0. 5、1、5 和 10 μmol /L 外消旋雌马酚或雌马酚对映异构体的培养液 100 μL， 每个浓度设置 10 个复孔。培养 24、48、72 和 96 h 后，加入 10 μL MTT，继续孵育 1. 5 h 后终止。在 570 nm 和 650 nm 波长处测定吸光度( A) 。计算 HCT-15 细胞的增殖率( proliferation rate，PＲ) 和抑 制率( inhibition rate，IＲ) ，计算公式为: 增殖率 = A570－A630，抑制率= ( 增殖率对照组 －增殖率实验组 ) /增 殖率对照组 ×100%。

1. 4 蛋白质表达水平测定

将对数生长期的 HCT-15 细胞用含 10%胎牛 血清的培养液配成单细胞悬液，每孔 5×104 个细 胞接种到 6 孔板，每孔体积 2 mL。过夜后加入 0、 0. 5、1、5 和 10 μmol /L 外消旋雌马酚或其对映异 构体，48 h 后 加 入 含 1 mol /L 苯 甲 基 磺 酰 氟 ( PMSF) 的细胞裂解液，冰上裂解 30 min 后，4 ℃， 12 000 r /min 离心 5 min 取上清，用聚氰基丙烯酸 正丁酯( butyleyanoacrylate，BCA) 蛋白浓度测定法 进行定量。50 μg 总蛋白等量上样，10%聚丙稀铣 胺凝 胶 电 泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE) 分离蛋白，湿法转至聚偏氟乙烯膜。5%脱 脂奶室温封闭 2 h 后，EＲα、EＲβ、Nrf2 和 β-actin 一抗用 5%脱脂奶 1 ∶200 稀释，4 ℃ 孵育过夜。用 TBST 缓冲液( tris buffered saline，with tween-20， pH 8. 0) 漂洗 3 次后加入二抗，室温孵育 1 h，使 用增强荧光发光试剂显影，然后使用图像成像系 统检测条带。

1. 5 统计学分析

用 SPSS 22. 0 统计软件进行分析，多组间比 较用方差分析，进一步两两比较采用 SNK 检验， 显著性水准 α = 0. 05。

2 结果

外消旋雌马酚及( Ｒ) 雌马酚可 以抑制大肠癌 HCT-15 细胞的增殖( P＜ 0. 05) ，且 随着剂量增加抑制作用增强，而( S) 雌 马 酚 对 HCT-15 细胞的增殖没有明显影响( P＞0. 05) 。外消旋雌马酚和( Ｒ) 雌马 酚对 HCT-15 细胞增殖的抑制率呈先上升后回落 的趋势，在第 3 天左右达到最大，此时外消旋雌马 酚的 IC50 为 59. 6 μmol /L，( Ｒ) 雌 马 酚 的 IC50 为5. 1 μmol /L。此外，Nrf2 蛋白表达也随外消 旋雌马酚浓度的增加而增加。( Ｒ) 雌马酚刺激 HCT-15 细胞后，Nrf2 蛋白表达随其浓度的增加而 增加，但未发现 EＲ 表达水平受到影响。

3 讨论

有研究报道大豆异黄酮的摄入可以减少大肠癌的发病风险，但是大豆异黄酮的代谢产物雌马 酚，尤其是雌马酚对映异构体对大肠癌的影响少 有研究。本研究以大肠癌 HCT-15 细胞为研究对 象，探讨了外消旋雌马酚及雌马酚对映异构体对 大肠癌细胞增殖的影响及其机制。结果显示，外 消旋雌马酚可通过上调 EＲβ 和 Nrf2 表达来抑制 HCT-15 细胞增殖，( Ｒ) 雌马酚可通过上调 Nrf2 表 达来抑制 HCT-15 细胞增殖，( S) 雌马酚对 HCT15 细胞增殖没有影响。