上海博讯分析大鼠大脑皮质星形胶质细胞纯化过

将 3 mL 0. 1 g /L L-多聚赖氨酸溶液注入用于 接种细胞的 T75 培养瓶中过夜，用无菌 PBS 洗 3 次，每次 10 min，常温，置于无菌超净台内，1 h 内 接种细胞。用于差速粘附及传代的培养瓶和培养 皿无需此处理。眼科弯镊、直镊及弯剪需提前浸 泡酒精，高压烘干。将细胞悬 液接种至未用多聚赖氨酸处理过的 T75 培养瓶 中，37 ℃、5% CO2 培养 15 min，吸出剩余未贴壁 的星形胶质细胞悬液，轻柔吹打混匀后，将细胞以 5× 106 /mL 接种至多聚赖氨酸包被预处理过的 T75 培养瓶，37 ℃、5% CO2 培养。每隔 3 d 换液， 待细胞融合到 90%左右时，进行下一步操作。 细胞长满 瓶 底 后，更换完全培养基，37 ℃ 恒 温 摇 床 200 r /min振荡 18 h。将培养瓶中上清液迅速倒 掉，用 PBS 洗 3 次，将每瓶细胞加入 1 mL 0. 25% 胰蛋白酶 37 ℃ 消化，倒置显微镜下观察，待细胞 突触回缩、大部分细胞脱落时，加入完全培养基终 止消化。反复吹打瓶壁，收集细胞，用于实验或 传代。

将第一代( P1) 、第二代( P2) 、第三代( P3) 细 胞消化后取 100 μL 接种于 96 孔板中培养 4 h，加 入 MTS 溶液 20 μL 后，继续在 37 ℃、5%CO2 博讯常温培养箱（上海博迅HPX-9082MBE电热恒温培养箱）内孵育 4 h。每组重复 3 次，酶标仪检测 λ = 490 nm 条件下吸光度值( A) 。免疫荧光法检测星形胶质细胞特异性标志 GFAP，GFAP 阳性细胞在荧光显微镜下发出绿色 荧光，DAPI 染色后所有细胞的细胞核呈蓝色，可见细胞胞体较大、突触较长。随机选取 3 个视野，计算阳性率为( 97. 86±0. 91) %。

星形胶质细胞的分裂高峰发生在动物胚胎晚 期及出生以后，同时大脑皮层中混杂的神经元在 出生后不再增殖，因此星形胶质细胞的来源一般 选择新生哺乳动物。由于出生 1 d 内鼠脑较小， 大脑皮层不易剥离，且出生 3 d 后大鼠大脑沟回 开始形成，软脑膜与脑组织不易剥离，会造成软 脑膜中成纤维细胞的干扰，因此本实验选取出 生 2 d 的 SD 大鼠作为细胞来源。生 2 d 的 SD 大鼠作为细胞来源。 此外，0. 25%胰蛋白酶消化组织的时间可影 响星形胶质细胞纯度及增殖活力，消化 40 min 时 细胞会有明显损伤，因此本实验严格控制消化时 间在 15 min。值得注意的是，虽然目前大多数研 究者使用 0. 25%胰蛋白酶消化组织制备单细胞 悬液，但其中的胰蛋白酶添加量并未提及。本 实验发现，胰酶添加量取决于组织块的大小，添加 量过多会导致细胞过度消化，添加量过少导致组 织消化不充分。因此本实验将胰蛋白酶添加量设 定为每 2 只鼠脑皮质加入 500 μL 胰蛋白酶，可避 免细胞消化过度，导致大部分细胞死亡。 差速贴壁法和恒温振荡法为星形胶质细 胞培养中最常用的方法。差速贴壁法利用了成纤 维细胞贴壁时间短，星形胶质细胞贴壁时间长的 特性，可以很好地分离两种细胞。在部分研究中采用恒温振荡法以去除附着的小胶质和 少突胶质细胞，将细胞置于 37 ℃ 恒温箱中，以 250 r /min 的速度进行振荡，虽然能够起到纯化作 用，但得到的星形胶质细胞数量相对减少，因此本 实验采用 200 r /min 的速度恒温振荡 18 h，得到相 对较多且纯度较高的星形胶质细胞。