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1 仪器与试剂
1.1 仪器
BSA2214 型天平(赛多利斯)，SK8210LHC 型超声波清洗仪(上 海科导超声仪器有限公司)，DGG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱 (上海森信实验仪器有限公司)，WFZ UV-2000 型紫外可见分光光 度计(尤妮柯(上海)仪器有限公司)，JY1002 电子天平(上海舜宇恒 平科学仪器有限公司)，SSW 型微电脑电热恒温水槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2 试药
预处理过的石蛙皮、L-羟脯氨酸标准品(上海金穗生物科技有 限公司)、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸溶液、冰乙酸、正丙醇、正 丁醇、异丙醇、氯胺T、Na2CO3等均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 原理
该方法源于国标 GB/T9695-23-2008。样品用硫酸在高温下水 解，氧化羟脯氨酸，加入对二甲氨基苯甲醛显色，在 558nm 波长 下进行测定。胶原蛋白含量%=试样中羟脯氨酸的含量*11.1。
2.2 试剂
2.2.1 氯胺 T 溶液的配制
称取 0.7g 氯胺 T，并用 50 mL 缓冲溶液溶解。
2.2.2 缓冲溶液(pH=6.8)的配制
一水柠檬酸 26.0g，氢氧化钠 14.0g 和无水乙酸钠 78.0g，并 500 mL 水溶解上述所配试剂移入 1L 的容量瓶中，再加入 250 mL 正丙醇，用水定容。
2.2.3 显色剂的配制
称取 2g 对二甲氨基苯甲醛，并用 7 mL 的高氯酸溶液(60%(质 量分数))溶解，缓慢加入 13 mL 异丙醇。该试液必须在临用前配 置。
2.2.4 羟脯氨酸标准液的配制
首先称取 50.1mg 羟脯氨酸于 100 mL 量瓶中，用水溶解，再 加硫酸溶液，用水定容。
2.2.5 羟脯氨酸标准溶液液的配制
先移取 2.50 mL 所配的羟脯氨酸标准液至 250 mL 量瓶中，用 水定容。分别精密吸取该溶液 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL 置 50 mL 量瓶中，水定容，所得羟脯氨酸标准工作液的浓度 依次为 0.501 µg/mL、1.002µg/mL、1.503µg/mL、2.004µg/mL、2.505µg/mL。该试液在临用前配用。
2.3 样品的处理
(1)称取 2.2g 试样于烧瓶中，应避免试样粘在烧瓶壁；再量取 30 mL 的硫酸溶液(3mol/L)，加入烧瓶中，用表面皿盖住，恒温于 105℃的干燥箱中 16h。趁热过滤至 250 mL 量瓶中，并用 10 mL 硫酸溶液洗涤，洗涤液并入量瓶中，用水定容，摇匀。精密移取 4 mL 酸水解液至 250 mL 量瓶中，定容，摇匀，即得。 (2)移取 4 mL 样品溶液于比色管中，加入 2 mL 氯胺 T 试剂， 混合后，于室温下放置 20min。在比色管中加入 2.00 mL 显色剂， 混合，封住比色管的瓶口并迅速放入 60℃水浴中加热 20min。取 出比色管，用流动水冷却比色管不少于 3min，在室温下静置 30min。取上述澄清液体，用水作参比，于 558nm 处用分光光度 计测定吸收值，将检测出的吸收值扣除空白溶液的吸收值，从 3.5 所得标准曲线计算得到羟脯氨酸的含量。
3 胶原蛋白的提取工艺条件筛选
在料液比 1∶15(溶剂为 0.5mol/L 的乙酸溶液)下，加入石蛙 皮质量 2.5‰的胃蛋白酶，提取 24h，温度分别在 10℃、15℃、20℃、 25℃、30℃、35℃时进行提取。当温度由 10℃上升到 25℃过程中，胶原蛋白得 率上升幅度明显；当提取温度再继续上升，胶原蛋白得率缓慢增 加。据有关报道，水产胶原蛋白变性温度较低，大约在 37°左右， 基于这一点，石蛙皮中胶原蛋白的提取温度选择 25℃为宜。酶浓度的变化对石蛙皮中胶原蛋白得率有一定 的影响，当酶的添加量上升，胶原蛋白得率也不断增加，直到酶 的添加量达到 3‰之后，胶原蛋白得率基本趋于稳定，不再显著 上升，所以确定酶添加量的最佳值为 3‰。
4 讨论
(1)通过对石蛙皮中的胶原蛋白的提取，利用酸酶结合的方 法，以及利用紫外分光光度计检测羟脯氨酸的含量，最终换算出 蛙皮中胶原蛋白的得率。但其试验并没有测出胶原蛋白的类型， 也需要更进一步的精制。 (2)同时在进行紫外分光检测时，观察到部分溶液由混浊现 象，则应该等溶液反应澄清或使用超声波促进溶解，过滤或加热 处理，待溶液澄清了再进行测定。 (3)实验研究了对提取胶原蛋白的多种影响因素，经过筛选， 提取工艺为：胃蛋白酶加入量为 3.0‰；酶解温度为 25℃；酶解 时间为 24h；料液比为 1∶20。该工艺稳定可行，可用于石蛙皮中 胶原蛋白的提取。
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