尖吻蝮蛇毒对人卵巢癌细胞的抑制作用研究-博迅

卵巢癌为高度异质性肿瘤，在妇科恶性肿瘤发生率排名中位居第三（排名前两位的依次为子宫内膜癌和宫 颈癌），致死率则居妇科恶性肿瘤之首。根据统计资料显示，全世界每年诊断出的卵巢癌患者约有２３９０００例， 而死于卵巢癌的患者约有１５２０００人。

１材料与方法

１．１ 材料

成年尖吻蝮蛇购自湖南省湘西土家族苗族自治州乌龙山，采用咬皿法制备蛇毒，经冷冻干燥后置于－２０ ℃ 低温保存备用。Ａ２７８０细胞购买于 ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）。

１．２ 仪器与试剂

本研究所用的主要仪器为：ＧＩ５４Ｄ高压灭菌器（美国 ＺＥＡＬＷＡＹ 公司）、高温烘烤箱（上海精宏实验设备有 限公司）、超净工作台（上海博讯实业有限公司）、ＴＧＬ－１６Ｂ台式离心机（上海迪索仪器有限公司）、ＭＣＯ－１５ＡＣ二 氧化碳培养箱（日本ＳＡＮＹＯ 公司）、ＴＨ４－２００倒置荧光显微镜（日本 ＯＬＹＭＰＵＳ公司）、ＴＧＬ－２０高速冷冻离心 机（四川蜀科仪器有限公司）和酶联免疫检测仪（美国 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）。主要耗材与试剂为：２５ｃｍ２ 细胞培养瓶和 细胞培养板（美国 Ｃｏｒｎｉｎｇ公 司）、细 胞 计 数 板（上海新睿生物科技有限公司）、Ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ／ＤＭＥＭ－Ｈ（美 国 Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司）、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（美国 Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司）、ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（美国 Ｓｉｇｍａ公司）、青霉素－链霉 素（美国 ＨｙＣｌｏｎｅ公司）、ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（美国 ＨｙＣｌｏｎｅ公司）和 Ｔｒｙｐｓｉｎ０．２５％（１×）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （美国 ＨｙＣｌｏｎｅ公司）。

１．３ 方法

１．３．１ 细胞培养

培养 Ａ２７８０细胞时，培养液选择 ＤＭＥＭ 培养基加质量分数为１０％的 ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ 和 １００Ｕ·ｍＬ－１的青霉素－链霉素，置于３７℃、体积分数为５％的ＣＯ２ 以及饱和湿度的培养箱中培养。Ａ２７８０细胞 呈贴壁生长。后续实验中，有关 Ａ２７８０细胞的培养液配方以及培养箱中的理化参数均保持不变。

１．３．２ 不同质量浓度蛇毒对 Ａ２７８０细胞的形态学影响

采用徐平等人的方法并稍作修改：取对数期生长的 Ａ２７８０细胞，经胰酶消化成悬液，使细胞密度为２．５×１０５个·ｍＬ－１，接种于２４孔板中，置于培养箱中培养；细胞 贴壁后弃上清，用ＰＢＳ清洗１次，每孔加入９００μＬ培养液，再加入不同质量浓度的蛇毒样品各１００μＬ，使蛇毒的 终质量浓度分别为３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００和２００μｇ·ｍＬ－１，而空白对照（蛇毒质量浓度为０）加入等量的 ＰＢＳ，置于培养箱中培养１２ｈ，之后拍照记录细胞形态变化。

１．３．３ 不同蛇毒作用时间对 Ａ２７８０细胞的形态学影响

仍然采用徐平等人的方法并稍作修改，且在加入蛇毒 前的操作步骤同１．３．２部分；然后加入蛇毒１００μＬ 使蛇毒的终质量浓度为５０μｇ·ｍＬ－１，以未加蛇毒为对 照 （即０ｈ），置于培养箱中培养１，６，１２ｈ，并在以上时间点拍照记录细胞形态变化。

１．３．４ 蛇毒对 Ａ２７８０细胞增殖活力的影响

采用ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８）试剂盒检测蛇毒对 Ａ２７８０细胞增 殖能力的影响，根据试剂盒说明书进行如下操作：取对数期生长的 Ａ２７８０细胞，经胰酶消化成悬液，使细胞密度 为２．５×１０５个·ｍＬ－１，接种于９６孔板中，置于培养箱中培养，细胞贴壁后弃上清；用 ＰＢＳ清洗１次，每孔加入 ９０Ｌ培养液，再加入不同质量浓度的蛇毒样品各１０μＬ，使蛇毒的终质量浓度分别为３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０， １００和２００μｇ·ｍＬ－１，空白对 照（蛇毒质量浓度为 ０）加 入 等 量 的 ＰＢＳ，每 组 ６ 个 复 孔；再 置 于 培 养 箱 中 培 养 １２ｈ，每孔加入１０μＬＣＣＫ－８，在培养箱中孵育１ｈ；酶联免疫检测仪于４５０ｎｍ 波长检测吸光度，采用以下公式进 行细胞增殖活力的计算： Ｖ＝Ａ２－Ａ０ Ａ１－Ａ０ ×１００％。 其中：Ｖ 为细胞增殖活力；Ａ０ 为有培养基、ＣＣＫ－８但无培养细胞孔的吸光度；Ａ１ 为有培养细胞、ＣＣＫ－８、ＰＢＳ孔 的吸光度；Ａ２ 为有培养细胞、ＣＣＫ－８溶液、蛇毒样品孔的吸光度。

１．３．５蛇毒对 Ａ２７８０细胞粘附能力的影响

在李博等人方法基础上稍作修改：取对数期生长的 Ａ２７８０细胞， 经胰酶消化成悬液，使细胞密度为２．５×１０５个·ｍＬ－１，接种于２４孔板中，加入１００μＬ 不同质量浓度的蛇毒样 品使得蛇毒终质量浓度分别为３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００和２００μｇ·ｍＬ－１，空白对照（蛇毒质量浓度为０）加 入等量的ＰＢＳ，轻轻摇匀，置于培养箱中孵育１２ｈ；再用ＰＢＳ清洗两次，于显微镜下拍照，并随机选择３个视野进 行计数（放大倍率为１０×２０倍），以粘附率来表示 Ａ２７８０细胞的粘附能力：其中：Ｒ 为粘附率；Ｑ１ 和Ｑ０ 分别为蛇毒处理后的培养细胞数量和空白对照的培养细胞数量。

１．３．６ 数据统计

本研究所得数据均用ｘ珚±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１８．０软件对细胞增殖活力、粘附率等数据进行单 因素方差分析，当ｐ＜０．０５时，分析结果具有统计学意义。

２结果与分析

不同质量浓度的尖吻蝮蛇毒作用于 Ａ２７８０细胞１２ｈ后，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态。结果显示：空 白对照 Ａ２７８０细胞贴壁良好，轮廓清晰，分布均匀，呈规则形态；当蛇毒质量浓度为３．１２５μｇ·ｍＬ－１时， Ａ２７８０细胞皱缩、变圆，出现少量凋亡的现象；随着蛇毒质量浓度的增加，大量 Ａ２７８０细胞皱缩、变圆、黏 连成团，出现明显的凋亡现象。以上结果说明尖吻蝮蛇毒可诱导 Ａ２７８０细胞凋亡，且两者呈剂量依赖 关系，即：蛇毒剂量越大，细胞凋亡现象越明显。为探究不同时间条件下尖吻蝮蛇毒对 Ａ２７８０细胞的形态学影响，选用５０μｇ·ｍＬ－１的蛇毒作用于 Ａ２７８０ 细胞，结果如图２所示：未加蛇毒时，Ａ２７８０细胞贴壁良好，轮廓清晰，分布均匀，呈规则形态；当蛇毒处理 Ａ２７８０细胞１ｈ时，少量被处理细胞出现皱缩、变圆的现象；当蛇毒处理 Ａ２７８０细胞６ｈ时，大量被处理 细胞皱缩、变圆的现象；当蛇毒处理 Ａ２７８０细胞１２ｈ时，被处理细胞粘连成团并大量出现凋亡现象。以 上结果说明尖吻蝮蛇毒诱导 Ａ２７８０细胞凋亡的时间越长，细胞凋亡现象越明显。

３讨论

肿瘤细胞主要特征是无限增殖、侵袭和转移。肿瘤细胞侵袭和转移机制复杂，涉及许多调控因子、细胞因子 等之间的相互作用———这是导致肿瘤恶性发展的主要原因。细胞之间粘附能力的变化是细胞转移的初始阶段， 并有助于肿瘤细 胞 从 原 发 部 位 脱 落，侵润周围的组织，启 动 转 移 程 序。本 研 究 中，经尖吻蝮蛇毒处理的 Ａ２７８０细胞形态发生了明显变化：细胞变小、变圆、皱缩，且蛇毒质量浓度及时间与 Ａ２７８０细胞的形态变化呈剂 量依赖关系。Ａ２７８０细胞形态的变化可能是由于尖吻蝮蛇毒破坏了细胞结构，从而影响了维持细胞正常形态的 功能。当尖吻蝮蛇毒的质量浓度为２５μｇ·ｍＬ－１时，Ａ２７８０细胞活力低于５０％，显示蛇毒对该细胞具有明显 的抑制细胞增殖作用。蛇毒抑制癌细胞增殖主要通过两个途径：一是上调抑癌基因表达与下调促癌基因表达， 二是阻滞细胞周期。但尖吻蝮蛇毒抑制 Ａ２７８０细胞增殖的具体途径还有待进一步的研究。在本研究中，当 尖吻蝮蛇毒质量浓度高于６．２５μｇ·ｍＬ－１时，Ａ２７８０细胞粘附率锐减，其中原因有可能是蛇毒引起受处理细胞 的紧密连接蛋白表达异常，从而导致细胞连接完整性被破坏，继而使细胞之间粘附能力。然而，尖吻蝮蛇 毒影响 Ａ２７８０细胞粘附的分子机制也有待进一步探究。