原发性痛经的镇痛作用及机制研究-BGZ-240使用

原发性痛经系指非盆腔器质性病变引起的痛 经，以患者下腹部痉挛性疼痛为主要临床表现。本 病多发于青年女性，国内报道其发病率约为 43% ~ 69%。国外流行病学调查显示，原发性痛经的发病 率由 34%（埃及）至 94%（阿曼）不等，其中重度痛经 的患病率约为 0.9%~59.8%。随着生活压力增加、 饮食结构改变等因素的影响，原发性痛经的发病率 呈逐年上升趋势，对女性的生活与工作造成了严重影响。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

NewClassic MF 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Xianou-24 高通量多样品组织 研磨机 （南京先欧仪器制造有限公司）；Varioskan Lux 多 功 能 微 孔 板 读 数 仪 （美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司）；Wellwash 全 自 动 洗 板 机 （美 国 Thermo Fisher Scientific 公司）；BGZ-240 电热鼓风干燥箱 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂）； ProFlex Base PCR 系统 （美国 Applied Biosystems 公 司）；Milli -Q Integral 5 超 纯 水 系 统 （美 国 Merck Millipore 公司）；Legend Micro 21R 冷冻高速离心机 （美国 Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 实验药品与试剂

元胡止痛口服液的处方由 醋延胡索、白芷两味中药组成，辅料为蔗糖、β 环糊 精、甜菊素、纯化水，由河南福森药业有限公司提 供，批号：18090121，实验时用蒸馏水稀释成所需浓 度的溶液。罗通定片的有效成分为延胡索乙素（每 片 30 mg），购自山西云鹏制药有限公司，批号： G180302，实验时取出片剂研磨成细粉，加入蒸馏水 与 0.5%（W/V）羧甲基纤维素钠，配制成所需浓度的 混悬液。己烯雌酚（上海源叶生物科技有限公司，批 号：X13M6Y1）；缩宫素（大连美仑生物技术有限公 司，批号：N1108A）；羧甲基纤维素钠（上海申光食用 化学品有限公司，批号：20180816）；肝素钠（北京索 莱宝科技有限公司，批号：409G024）；水合氯醛（上 海源叶生物科技有限公司，批号：Z23A9Y68668）。 E2 酶联反应吸附实验（ELISA）检测试剂盒（批号： L181010239） 与 PGF2a ELISA 检测试剂盒 （批号： L181023119） 购自武汉云克隆科技股份有限公司。 大鼠 Prog ELISA 检测试剂盒 （批号：20181112005） 购自武汉六合生物技术有限公司。大鼠 PGE2 ELISA 检测试剂盒（批号：C0174080121）、大鼠 TXB2 ELISA 检测试剂盒 （批号：A27017483） 与大鼠 6-ketoPGF1α ELISA 检测试剂盒（批号：D10017485）购自武 汉华美生物工程有限公司。MDA 检测试剂盒（批号： 082418181030）、总 SOD 活性检测试剂盒 （批号： 092618181030）、GSH -Px 检 测 试 剂 盒 （ 批 号 ： 060518181114）、NO 检 测 试 剂 盒 （ 批 号 ： 052218181029）与 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号： 070618181017） 购自上海碧云天生物技术研究所。 Ca2+ 试剂盒（批号：20181123）购自南京建成生物工 程研究所。

1.3 实验动物

SD 大鼠，雌性，体质量 180~200 g， SPF 级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2017-0001。饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，饲养设施合 格证号：SVXK 津 2009-0002。实验动物操作均遵从 中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委 员会审定的规范要求。

1.4 分组与造模方法

将 60 只健康雌性 SD 大鼠 按体质量随机分为 6 组，分别为空白组、模型组、元 胡止痛口服液高剂量组（高剂量组）、元胡止痛口服 液中剂量组（中剂量组）、元胡止痛口服液低剂量组 （低剂量组）以及罗通定片阳性药组（阳性药组），每 组 10 只。参考文献方法复制痛经大鼠模型。除空 白组外，其余各组大鼠灌胃给予己烯雌酚 2.00 mg/kg， 每日 1 次，连续 12 d。

1.5 给药方法

于造模第 6 天开始给药，根据预实 验结果，高剂量组、中剂量组、低剂量组大鼠分别以 3.20、1.07、0.36 g/kg 剂量灌胃给予元胡止痛口服液。 根据实验动物与人之间药物剂量等效换算方法，阳 性药组大鼠灌胃给予罗通定混悬液 0.03 g/kg。空白 对照组与模型组灌胃等体积蒸馏水，各组大鼠每日 给药 1 次，连续给药 7 d。

1.6 扭体反应观察

于造模第 12 天，末次给药 1 h 后，模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组与阳性 药组大鼠腹腔注射缩宫素 40 U/kg，空白组注射等体 积生理盐水。记录注射缩宫素后 30 min 内各组大鼠 发生扭体反应（腹部收缩内凹，躯干与后肢伸展，臀 部与一侧肢体内旋）的数量以及扭体次数，并按公 式 1 计算大鼠的扭体发生率。 扭体发生率（%）=发生扭体反应动物数量/实验 动物数量×100%（公式 1）

1.7 检测指标

注射缩宫素 1 h 后，各组大鼠腹腔 注射 3.50%（V/V）水合氯醛溶液（0.10 mL/kg）麻醉， 腹主动脉采血，加入肝素抗凝管，于 1 500 g，4 ℃条 件下离心 5 min，取上清液，采用 ELISA 法测定大鼠 血浆 E2 与 Prog 水平，采用 TBA 法检测大鼠血浆 MDA 含量，运用 WST-8 法测定血浆 SOD 活性，并 采用紫外比色检测 GSH-Px 活性。 另于采血后取大鼠子宫组织，精密称质量，加 入生理盐水，在冰浴下制成 10%（W/V）的组织匀浆， 于 1 500 g、4 ℃条件下离心 10 min，分离上清液，采 用ELISA 法测定大鼠子宫组织匀浆中 PGF2α、PGE2、 TXB2、6-keto-PGF1α 水平。采用甲基百里香酚蓝比色 法测定组织匀浆中 Ca2+ 含量，运用 Griess 试剂法测 定 NO 含量，并采用 BCA 法测定大鼠组织匀浆总蛋 白含量。上述测定方法均按各试剂盒说明进行，实验数据采用 ELISACalc 软件进行分析，以四参数 Logistic 曲线模型拟合标准曲线，并通过标准曲线计 算各样本浓度。

1.8 统计学方法

采用 SPSS 19.0 软件进行统计分 析，实验结果以均数±标准差（x±s）表示，正态分布资 料采用单因素方差分析比较多组间差异，偏态分布 资料采用 Wilcoxon 秩和检验分析，P<0.05 表示差异 有统计学意义。

2 结果

空白组大鼠未出现扭体反应， 模型组大鼠在注射缩宫素后 30 min 内的扭体发生 率为 90%，提示动物模型成功建立。与模型组相比， 阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组大鼠扭体 发生率均有不同程度的降低，其中高剂量组与阳性 药组大鼠扭体反应次数显著减少，差异具有统计学 意义（P<0.05），详见表 1。

与正常大鼠相比，原发性 痛经模型大鼠血浆 E2 水平显著升高（P<0.01），血浆 Prog 水平显著降低（P<0.05）。但阳性药与元胡止痛 口服液给药后，模型大鼠血浆 E2 与 Prog 水平均未 见显著回调。见图 1。

3 讨论

原发性痛经的主要症状表现为周期发作的下 腹部痉挛性疼痛，缩宫素诱导的痛经动物模型是观察原发性痛经疼痛程度的首选模型，而扭体反应则 是评价动物疼痛程度的经典行为学指标，目前在原 发性痛经的机制与防治研究中有广泛应用。本研 究首先灌胃给予大鼠己烯雌酚以提高子宫敏感性， 之后注射缩宫素诱发子宫痉挛性收缩，观察到模型 大鼠出现典型的扭体反应，与文献报道一致，提示 痛经大鼠模型的成功建立。进一步研究发现，元胡 止痛口服液可显著减少痛经大鼠扭体反应发生次 数，降低大鼠扭体反应发生率，提示元胡止痛口服 液对缩宫素诱导的痛经大鼠模型具有显著的镇痛作用。