用博迅工作台对减轻退变软骨细胞的损伤

1 材料和方法 

1.1 设计 

细胞学实验。 

1.2 时间及地点 

实验于2017年9月至2018年9月在广西 医科大学基础实验室完成。 

1.3 材料 

1.3.1 动物 

清洁级新生24 h内的雄性SD大鼠2只，由广 西医科大学实验中心提供，动物许可证号 SCXK 桂 2014-0002。实验于2017年10月经广西医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号201710008。 

1.3.2 主要试剂 

原儿茶酸(纯度≥98%，白色结晶粉末)、 100×青霉素-链霉素、0.25%胰蛋白酶、苏木精-伊红染色 试剂盒购自北京索莱宝有限公司；胎牛血清、DMEM培养 基购自Gibeo公司；黄绿素、MTT、碘化丙啶(PI)购自美国 Invitrogen公司；Ⅱ型胶原一抗、DAB显色试剂盒购自博士 德公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；PBS购自迈新 公司购；番红染色试剂盒购自基尔顿生物科技(上海)有限 公司；总RNA提取试剂盒购自天根公司。 

1.3.3 主要仪器 

二氧化碳恒温培养箱购自赛默飞世尔 科技(中国)有限公司；倒置相差显微镜购自Olympus公司； 全波长酶标仪、微量紫外分光光度计购自Themo公司；超 净工作台购自上海博迅实业有限公司；荧光实时定量PCR 仪购自美国Eppendorf公司。 

1.4 方法 

1.4.1 软骨细胞的提取与培养 

将2只乳鼠拉颈处死，浸泡 于体积分数75%乙醇中消毒15 min后，无菌条件下切除两侧 股骨，用眼科剪将股骨两端软骨剪下，用含青链霉素双抗液 的PBS冲洗数次；将软骨组织剪碎至约1 mm3 大小，转移到 15 mL离心管中加入0.25%胰蛋白酶消化30 min，弃上清液， PBS清洗3次，加入2 g/L的Ⅱ型胶原酶并置入体积分数5% CO2的37 ℃恒温培养箱中消化3.0-4.0 h。200目不锈钢筛网 过滤后，收集细胞，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入 含体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养 基，用吸管反复吹打重悬细胞，接种于10 cm培养皿中，于 37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中培养。24 h后换培养液除 去未贴壁细胞，之后每3 d换液，细胞融合后用0.25%胰酶消 化3-5 min，含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基终止消 化，按1∶3的比例传代。取第3代细胞用于后续实验。 

1.4.2 细胞毒性测定 

以MTT法测量原儿茶酸对关节软骨 细胞的细胞毒性作用。将细胞按2 000个/孔接种于96孔培养 板中，8 h后更换含有不同浓度原儿茶酸(1-150 mg/L)的 DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)，继续培养24 h。 每孔加 20 mL MTT(5 g/L)，置于细胞培养箱中4 h；去培养 基，每孔加150 μL DMSO，孵育10 min，酶标仪测量570 nm处的吸光度值。

1.4.3 细胞分组与干预 

第3代软骨细胞分为5组：空白 组、模型组、原儿茶酸低剂量(10 mg/L)组、原儿茶酸中剂 量(30 mg/L)组、原儿茶酸高剂量(50 mg/L)组，每组设置3 个副孔。其中空白组仅加入培养液；模型组加入含10 mg/L 的白细胞介素1β的培养液；原儿茶酸低、中、高剂量组加 入含10 mg/L白细胞介素1β的培养液以及10，30，50 mg/L 原儿茶酸。干预时间为24 h。

2 结果 

2.1 原儿茶酸对大鼠软骨细胞增殖抑制作用 

MTT检测 结果显示，在10-50 mg/L的浓度范围内，原儿茶酸能够明 显促进软骨细胞的增殖，其中30 mg/L原儿茶酸的生长刺激 作用最强。大于50 mg/L的原儿茶酸可明显抑制软骨细胞的 增殖，见图1，因此实验选择10，30，50 mg/L作为后续实 验研究的有效浓度。 

2.2 原儿茶酸对大鼠软骨细胞 DNA 含 量 的 影 响 

Hoechst 33258结果显示，原儿茶酸中剂量组DNA含量接 近于空白组，原儿茶酸低剂量组和原儿茶酸高剂量组DNA 含量较原儿茶酸剂量组低，说明30 mg/L原儿茶酸能更有效 保护软骨细胞，促进软骨细胞的增殖，见图2。

3 讨论 

随着社会老龄化程度的进展，退行性骨关节炎病患越 来越多。骨性关节炎一般以疼痛、肿胀等临床症状多见， 给患者带来巨大的痛苦和经济上的负担。关节软骨由于缺 乏神经血管等组织，导致其再生能力较差。已有研究表明 关节软骨细胞是维持软骨基质的合成和分解代谢的惟一细胞类型并证明了关节软骨细胞的过度凋亡是骨关节炎发病的主要原因。

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