用博迅干燥箱对HepG2细胞胰岛素抵抗模型中脂代谢

1 材料与方法 

1. 1 材料

1. 1. 1 细胞株

HepG2 细胞人肝癌细胞株，购于中 国科学院细胞库。

1. 1. 2 药物及试剂

苦酸通调方( 长春中医药大 学附属医院药房提供) ; 二甲双胍( HY-17471A，MCE 公司) ; DMEM 低糖培养基、胎 牛 血 清( 12100061、 16140071，Gibco 公司) ; 细胞裂解液、噻唑蓝( MTT) 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒( P0013、C0201，武 汉碧云天生物公司) ; 棕榈酸( MB7088，大连美仑生 物技术有限公司) ; 油红 O 染色试剂盒、三酰甘油 ( TG) 检测试剂盒、胆固醇检测试剂盒( D027、A110、 A111，南京建成生物工程研究所) ; 兔抗人单克隆抗 体 AMPKα，单克隆抗体 p-AMPK( Thr172) ，单克隆 抗体乙酰辅酶 A 羟化酶( ACC) ，多克隆抗体 p-ACC ( Ser79) ( 美 国 Cell Signaling 公 司，批 号 分 别 为 5832，50081，9272，9336) ; 兔单克隆抗体 SREBP-1 ( 557036，美国 BD 公司) ; 辣根过氧化物酶标记山羊 抗兔多克隆抗体免疫球蛋白( Ig) G、辣根过氧化物 酶标 记 山 羊 抗 小 鼠 单克隆抗体 IgG ( BA1054、 BA1050，武汉博士德生物工程有限公司) ; 二喹啉甲 酸( BCA) 蛋白浓度测定试剂盒( A0216，碧云天生物 技术研究所) 。

1. 1. 3 仪器

湿化型 CO2 恒温培养箱( 3111，Thermo) ; YZ-875 超净工作台( 江苏苏州净化设备厂) ; 低温高速离心机( 5804R，德国 Eppendorf) ; DK-S2 微 型振荡器( 浙江金华实验仪器厂) ; 鼓风干燥箱( 上海博迅医疗生物仪器公司) ; M200 PRO 酶标仪( 瑞 士 Tecan 公司) ; 电泳仪( 美国 Bio-Rad 公司) ; 湿转 系统( 美国 Bio-Rad 公司) ; 超低温冰箱( 900，美国 Thermo Fisher) ; ECL 发 光 仪 ( 美 国 Protein Simple 公司) 。

1. 2 细胞培养

HepG2 细胞培养在 37℃，5%CO2 湿化 条 件 中，给 予 10% 胎 牛 血 清 ( FBS) 、青 霉 素 100 U/ml和链霉素 100 μg /ml 的低糖 DMEM 培养 基培养，待细胞融合度约 80%时进行传代。各干预 组加入无血清低糖 DMEM 培养基培养细胞 24 h，使 各组细胞生长同步化后再进行下一步实验。

1. 3 MTT 比色法检测细胞活力

将 MTT 溶于磷酸 盐缓冲液( PBS) 为 5 mg /ml 过滤除菌后备用，选择 细胞融合度约 80%的 HepG2 细胞，胰酶消化后，以 8 000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板。细胞贴壁生 长 24 h，吸弃原培养基，加入不同的干预液100 μl， 培养 24 h，每孔加入 MTT 溶液 10 μl，置细胞于培养 箱内避光孵育 4 h。震荡混匀，490 nm 处测定吸光 度。以对照组细胞的存活率为 100%计算不同组别 细胞存活率。

1. 4 高糖联合棕榈酸孵育建立

HepG2 IR 模型 称 取 9. 165 mg 棕榈酸标准品溶于 0. 25 ml 无水乙醇 中，将溶解后的棕榈酸加入 11. 88 ml 高糖 DMEM 培 养〔其中含有 0. 12 ml FBS，0. 25 g 牛血清白蛋白 ( BSA) 〕，55℃ 水浴 15 min，冷却后过滤除菌即为 3 mmol /L棕榈酸溶液，造模时稀释至 0. 25 mmol /L， 孵育细胞 24 h，建立 HepG2 IR 模型。

2 结 果

2. 1 对 HepG2 细胞葡萄糖摄取量的影响

与正常 组〔( 1. 00±0. 02) mmol /L〕比较，模型组细胞的葡萄 糖摄 取 量 明 显 下 降 〔( 0. 63 ± 0. 02 ) mmol /L，P ＜ 0. 05〕; 与模型组相比，苦酸通调方高剂量组、阳性 对照 组 显 著 增 多 HepG2 IR 细胞葡萄糖摄取量 〔( 0. 84± 0. 05) mmol /L，( 0. 93 ± 0. 02) mmol /L，P ＜ 0. 05〕，且增加细胞葡萄糖摄取量的效果呈剂量依 赖性。苦酸通调方低、中剂量组摄取量为〔( 0. 66± 0. 03) mmol /L，( 0. 72±0. 03) mmol /L〕与模型组无差 异( P＞0. 05) 。

2. 2 油红

O 染色 造模液作用后细胞内脂滴明显 增多，随着苦酸通调方浓度的增加，细胞脂滴逐渐减 少。见图 1。

3 讨 论

中医认为 T2DM 属“消渴”“脾瘅”范畴，苦酸通 调方依据六郁和络滞病机，确立“苦酸制甜”、“辛开 苦降”、“活血通络”、“解毒通络”为基本治法，选用 丹参、黄连、黄芪、知母、天花粉、制红曲、肉桂、乌梅、 生地、酒大黄组成本方。诸药辛苦酸并用，寒温相 佐，达到了苦酸制甜，辛开苦降，通达络脉之功。

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