污水中絮凝细菌的分离及鉴定（YXQ-50SII使用）

我国城市化进程发展越来越快，水资源需求量 也越来越大，水污染的程度也在大大的加深，污水处 理就成了目前急需解决的大问题。絮凝沉淀法与生 物处理、离子交换、吸附、化学氧化、电渗析、超滤和 等方法相比较之下较为廉价、操作更为简便。研究 发现能够产生絮凝剂的微生物种类很多，有报道的絮凝微生物种类已达 50 多种。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验所需污水、淤泥 采自于山东省临淄区金 岭回族镇的水渠; 营养琼脂培养基、营养肉汤培养 基、细菌生化鉴定管 杭州微生物有限责任公司; 无 水 CaCl2、高岭土、硫酸铝钾( 明矾) 化学纯，杭州微 生物有限责任公司。 博迅YXQ-50SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业 有限公司医疗设备厂; DHG－9140A 新型电热恒温鼓 风干燥箱 宁波江南仪器厂; 干燥箱 宁波江南仪 器厂; LＲH－150B 生化培养箱、ZWY－200D 恒温培养 振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司; G10S UV －VIS 双光束紫外可见分光光度计 Thermo Fisher Scientific 有限公司; S.SW－CJ－2F 净化工作台 上海 跃进医疗器械厂; BA210 生物显微镜 麦克奥迪实 业集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物的分离纯化

在污水渠的上中下游三 处采集污水和淤泥，装入密封袋 4 ℃ 冰箱保藏。将 采集的污水和淤泥分别以 ( 10 － 1、10 － 2、10 － 3、10 － 4、 10 － 5、10 － 6、10 － 7 ) 七个梯度稀释，每个梯度取 100 μL 涂布到 营 养 琼 脂 培 养 基 平 板 中，30 ℃ 培 养 48 h 观察。 取涂布平板中不同形态的单个菌落以四区划线 法接种在营养琼脂培养基平板上，30 ℃ 培养 48 h 后对平板中出现的不同形态的单个菌落进行连续多次 的分离划线培养，直至菌落形态稳定且单一，对分离 的菌株，通过简单染色，在显微镜下观察其基本形态 结构。

1.2.2 絮凝微生物的筛选

硫 酸 铝 钾 组: 分 别 取 200、400、600、800、1000 mg /L 的硫酸铝钾各 2 mL，浓 度为 1% 的氯化钙溶液 5 mL 和 4 g /L 高岭土悬浊液 93 mL 于 250 mL 三角烧瓶中，空白组以 2 mL 蒸馏水 代替 2 mL 的硫酸铝钾。将三角瓶充分震荡 2 min 后 静置 8 min，再用微量加样器吸取上清液，测定 OD550 值。通过公式( 1) 计算絮凝率。

1.2.3 絮凝细菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

将筛选得到的菌种接种于营 养琼脂培养基上，在 30 ℃ 下培养 48 h，对菌株进行 革兰氏染色，油镜下观察菌体形态并拍照记录。

1.2.3.2 生化鉴定

对经筛选获得的絮凝作用最优 的两株菌以营养肉汤培养基 30 ℃ 下培养 24 h 至对 数生长期，将菌液按照无菌操作技术接入细菌生化 鉴定管中，30 ℃、100 r /min 条件下震荡培养 48 h 后 进行观察，并记录其结果。

1.2.3.3 分子生物学鉴定

将基因组对 16S rＲNA 进 行 PCＲ 扩增，引物为 16S: 27 － F: AGAGTTTGATCM TGGCTCAG，1492－Ｒ: TACGGYTACCTTGTTACGACTT PCＲ。扩增得到的絮凝菌的 PCＲ 产 物 在 浓 度 为 1.0% 琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳电压设置 120 V， 电泳时间设置 30 min。之后在 320 nm 波长紫外灯下 进行观察，将结果进行拍照、分析，将目的片段进行 回收，送于武汉金开瑞生物工程有限公司做序列 测序。 PCＲ 体系条件: H2O 17.8 μL，DNA Buffer 3 μL， dNTP 2 μL，上下引物均 3 μL，DNA 模板 1 μL，DNA 聚合酶 0.2 μL，总体积 30 μL。 PCＲ 扩增条件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s; 60 ℃ 30 s; 72 ℃ 1 min; 35 次循环; 72 ℃ 10 min; 12 ℃ 保存。

1.3 数据处理

将测序结果进行正反序列拼接得到全序列，再将测序结果经 NCBI 进行 Blast 比对，选择与比对序列相 似度 高 的 菌 株，以 MEGA5.1 软 件 进 行 分 析。利 用 MEGA 5.0 软件进行分析，并构建系统发育树。

2 结果与分析

菌株 ZF1、ZF2、ZF3、ZF5、ZF8、ZF12、ZF15、ZF18 和 ZF20 均为杆状细菌，其他均为球状; 各菌落形态以圆形为主，且光滑湿润; 各菌落颜色多 样，大小不一。ZF1 分解麦芽 糖、D－ 甘露醇、棉籽糖和山梨醇，不分解蔗糖、卫矛 醇、肌醇和乳糖; 氧化酶没反应可能为肠杆菌科; 靛 基质无反应; 可产生 DNA 酶; 硝酸盐未还原; 枸橼酸 盐阴性为肠杆菌科的埃希菌属、志贺菌属和爱德华 菌属等; 硫化氢为阴性可排除爱德华菌属; 明胶未液 化; O /F 实验阳性发酵型，进一步确认为肠杆菌。 ZF18 不分解麦芽糖、D－甘露醇、棉籽糖、山梨醇、蔗 糖、卫矛醇、肌醇和乳糖; 氧化酶阳性为假单胞菌; 靛 基质有气泡; 可产生 DNA 酶; 硝酸盐被还原; 枸橼酸 盐为阳性; O /F 实验为阴性; 硫化氢为阳性; 明胶液化进一步确定其为假单胞菌。

3 讨论与结论

从山东省临淄区金岭回族镇的水渠中采 集水样，经分离、筛选并富集培养后获得 2 株絮凝性 能稳定且活性良好的微生物絮凝菌 ZF1 和 ZF18，其 絮凝率分别为为 57.68% 、57.20% 。与周礼等［18］从活 性污泥种筛选出一株高效絮凝剂产生菌株，在最佳 发酵培养基中絮凝率达 95% 相比而言，本实验筛选 到的菌株仍需深入研究，例如对大颗粒物絮凝率的 高低、菌株生长和絮凝所需要的最佳条件和适宜的 外界环境的优化处理，絮凝微生物的絮凝分子提取 工艺以及絮凝剂的开发利用等。



 

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