蝉拟青霉提取液对小鼠的镇痛作用

疼痛是指组织损伤或与潜在的组织损伤相关的 一种躯体感觉和情感经历。镇痛药主要通过抑制中 枢神经系统和外周神经系统来发挥其镇痛作用。 中枢性镇痛药（如阿片类）是与中枢中相关受体结合 产生镇痛作 用，但 此 类 药 物 多 具 有 成 瘾 性。蝉拟 青霉（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｃｉｃａｄａｅ）为大 蝉 草 （Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｉｃａｄａｅＳ－ｈｉｎｇ）的分生孢子无性型阶段。蝉花是蝉 在土中的若虫被蝉拟青霉寄生致死的带菌尸体，在 其头部长菌丝 形 成 的 孢 梗 束 似 花 蕾 故 名 蝉 花，由 于蝉花生长的地理位置、生态环境的不同，导致蝉花 的形态各异。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 实验动物

ＳＰＦ级昆明种小鼠，雌雄各半，体 重２０ｇ±２ｇ，由中国人民解放军陆军军医大学提 供，许可证 ＳＣＸＫ（军）２０１２－００１１。雌雄 分 笼 在 室 温为２２℃±２℃，相对湿度在４０％～６０％的条 件 下 适应性饲养３ｄ，给药前禁食不禁水。

１．１．２ 试 验

菌 株 ２４ 株 蝉 拟 青 霉 分 别 采 自 贵 州 （ＧＺ）、四川（ＳＣ）、重庆（ＣＱ）、云南（ＹＮ）、浙江（ＺＪ）、 海南（ＨＮ）、陕西（ＳＸ）、广西（ＧＸ）及韩国（Ｋｏｒｅａ）的 蝉花，经分离鉴定纯化后保存于贵州大学真菌资源 研究所。

１．１．３ 主要试剂

罗通定（含量＞９７％），大连美仑 生物技术有限公司；氯化钠，天津市科密欧化学试剂 有限公司；冰醋酸（分析纯），天津市富宇精细化工有 限公司；羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ），天津市永大化 学试剂有限公司。

１．１．４ 主要仪器

生化培养箱（ＨＰＤ－１５０）、恒温恒 湿智能摇 床（ＺＷＹ－Ｃ２１１２Ｄ），购自常州市华普教学 仪器有 限 公 司；超 净 工 作 台（ＢＨＣ－１３００ＩＩＡ／Ｂ２），购自苏州净化设备有限公司；台式低速离心机（ＴＤＺ５－ ＷＳ），购自湘仪公司；可调高 速 匀 浆 机（ＦＳ－１），购自 常州国华电器有限公司；电子分析天平（ＦＡ２２０４Ｎｄ ＝０．０００１ｇ），购自 上 海 箐 海 仪 器 有 限 公 司；灭 菌 锅 （ＧＲ６０ＤＡ），购自厦门致微仪器有限公司；超纯水机 （Ｅｘｃｅｅｄ－Ｃｃ－２４），购自成都艾柯水处理设备有限公 司；电热鼓 风 干 燥 箱（ＧＺＸ－９１４０ＭＢＥ），购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

１．２ 方法

１．２．１ 培养基与试剂制备

液体培养基：取葡萄糖 ２０．０ｇ，蛋白胨３．０ｇ，酵母膏２．０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ， ＭｇＳＯ４０．５ｇ，超纯水定容至１０００ｍＬ，灭菌备用。 ＰＤＡ 斜面培养基：马铃薯２００ｇ，葡萄 糖２０ｇ， 琼脂２０ｇ，超纯水定容至１０００ｍＬ，灭菌，制成试管 斜面，备用。 ３５ｇ／Ｌ罗通定的配制：精确称取罗通定标准品 粉末３．５ｇ，用１０ｇ／ＬＣＭＣ－Ｎａ溶液溶解定容至１００ ｍＬ。 ７ｍＬ／Ｌ冰醋酸溶液配制：精确量取冰醋酸０．７ ｍＬ，用灭菌超纯水定容至１００ｍＬ，现配现用。

１．２．２ 蝉 拟 青 霉 菌 丝 体 提 取 液 制 备

参 照 谭 艾 娟方法制备。 菌种活化：将菌接种到 ＰＤＡ 试管斜面上，２５℃ 恒温培养７ｄ，备用。 种子培养：用 接 种 环 将 已 活 化 的 试 管 斜 面 菌 种 接种到装有５０ｍＬ 液体培养基的２５０ｍＬ的三角瓶 中，２５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养７２ｈ～９６ｈ。 发酵培养：将种子培养液按 ５％（７．５ｍＬ）的接种 量接种到装有１５０ｍＬ液体培养基的５００ｍＬ的三角 瓶中，２５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养７２ｈ～９６ｈ。 不同浓度蝉拟青霉菌丝体提取液的配制：将上述 摇瓶培养好的菌丝４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清， 称重，用玻璃匀浆器破碎细胞，分别按菌丝体：超纯水 ＝４、８、１６（ｇ∶Ｖ）的 比 例，加 入 超 纯 水 浸 提，然 后， ４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上 清 液，制 成 含 有１．２５、 ２．５０、５．００ｇ／ｋｇ的蝉拟青霉菌丝体提取液，备用。

１．２．３ 限量试验

参 照 徐 叔 云方法，取 小 鼠２０ 只，随机分为２组，每组１０只，雌雄各半。第１组为 蝉拟青霉组，一次经口给予０．２ｍＬ／１０ｇ的蝉拟青 霉菌菌丝体提取液，剂量为２０．００ｇ／ｋｇ；第２组为空 白对照组，经口一次 给 予 等 体 积 的 生 理 盐 水。连 续 观察１４ｄ，记录染药期间小鼠每天表现并于０、３、７、 １４ｄ称重，试验结束，后颈椎脱臼处死小鼠，剖检，称 取小鼠脏器重量，计算脏器系数（脏器系数＝脏器质 量／动物质量×１００％），并观察病理变化。

１．２．４ 不同剂量蝉拟青霉菌菌丝体提取液的镇痛作用观察

为了证明蝉拟青霉是否有镇痛效果并确定 对比试验的给药剂量，选取２４株中生长活性最好的 ２株 ＹＮ－１和ＳＣ－４蝉拟青霉应用小鼠扭体法，考 察其菌丝体提取液不同剂量的镇痛作用，取小鼠６０ 只雌雄各半，随 机 分 为 ５ 组，每 组 １２ 只，阴性 对 照 组、阳性药物对照组 和 高、中、低试验组分别灌服等 量生理盐水、３５ｇ／Ｌ罗通定和１．２５、２．５０、５．００ｇ／ｋｇ 的蝉拟青霉菌丝体提取液，每 次 ０．２ ｍＬ／１０ｇ， １次／ｄ，连续３ｄ；于末 次 给 药３０ ｍｉｎ 后，腹腔 注 射 ０．７％冰醋酸，立即计时并观察小鼠疼痛扭体反应的 潜伏期及产生扭体反应后１５ｍｉｎ内的扭体次数，按 下列公式计算镇痛百分率。 镇痛百分率＝（阴 性 组 平 均 扭 体 次 数－给 药 组 平均扭体次数）／阴性组平均扭体次数）×１００％。

１．２．５ 不同来源蝉拟青霉菌株镇痛作用对比研究

对２．４的镇痛结果分析，采用剂量为２．５０ｇ／ｋｇ，取小 鼠３１２只雌雄各半，随机分为２６组，每组１２只，应 用小鼠扭体法对比考察２４株蝉拟青霉菌菌丝体提 取液的镇痛效果，以期筛选出具有显著镇痛作用的 蝉拟青霉菌株。

１．２．６ 统计学分析

数据均采用“平均值±标准误” 表示。数据均 采 用 ＳＰＳＳ统计 软 件 进 行 处 理，进 行 方差统 计 学 分 析，Ｐ ＞０．０５ 表示 差 异 不 显 著，Ｐ ＜ ０．０５表示差异显著，Ｐ＜０．０１表示差异极显著。

２ 结果

与生理盐水组相比较，阳性药物罗通定的潜伏 期延长（Ｐ＜０．０５）、扭体次数下降（Ｐ＜０．０１）和镇痛 百分率最好。ＹＮ－１、ＳＣ－４的高中低剂量均能延长潜 伏期，其中 ＹＮ－１潜伏期延长作用明显（Ｐ＜０．０５）， 从对照组的４．２４ｍｉｎ延长至７．４４ｍｉｎ，超过罗通定。ＹＮ－１、ＳＣ－４菌丝体高、中剂量组均能显著地 降 低 冰 醋酸所致小鼠扭体次数（Ｐ＜０．０５）（表３）。２株菌均 能较大程度提高镇痛百分率，ＹＮ－１高、中、低组的镇 痛百分 率 分 别 为 ５９．４８％、６３．２２％ 和４３．１０％；ＳＣ－４高、中、低组的镇痛百分率分别为４５．９８％、５５．７５％和 ４０．２３％。因此，２株蝉拟青霉菌菌丝体提取液均有 镇痛作用，其中剂量组（２．５０ｇ／ｋｇ）镇痛效果最好。

3 讨论

化学刺激镇痛模型中的醋酸致小鼠扭体模型， 主要是通过注射冰醋酸后，引起腹腔急性炎症反应， 产生疼痛，作用部位在外周神经系统，用于考察外周 性镇痛药物镇痛作用的药物，操作简便，结果可靠。 实验数据表明具有较好镇痛活性的菌株主要集中在 全国云贵川３个省份及韩国，而云贵川３个省相邻， 气候环境条件相似，证明蝉拟青霉的镇痛活性会随 着地形气候的改变而改变。本研究中发现，２４株蝉 拟青霉菌菌丝体提取液均有不同程度的外周镇痛作 用，镇痛百分率 在３．４％～６４．８％之间，其 中 其 ＧＺ－３、ＹＮ－１及 Ｋｏｒｅａ－１的镇痛效果较好，与罗通定相近 有很大的研究潜力。



 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。