抗菌肽小试生产工艺优化-YXQ-100G使用

贝莱斯芽孢杆菌( Bacillus velezensis) Tu － 569 发 酵产生的胞外抗菌肽可抑制大肠杆菌、沙门氏杆菌、 痢疾杆菌等致腹泻病原菌的生长，且耐受胃肠道环 境、耐热性好，在畜牧养殖业极具应用潜力。T － 70－1 菌株是由 Tu－569 菌株经紫外－微波诱变获得 的菌株，其产抗菌肽能力是原菌株的 2. 74 倍。

1 材料

1. 1 菌株

贝莱斯芽孢杆菌( Bacillus velezensis) T－70－1、大肠杆菌( E． coli) ATCC 53832，均由河北农业大学制药 工程系实验室保存。

1. 2 主要试剂

牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉，均购自北 京奥博星生物技术有限公司; 葡萄糖、NaCl、MgSO4 · 7H2O、KCl、NaH2PO4 ·2H2O、Na2HPO4 ·2H2O 等，均购 自天津市永大化学试剂有限公司; 消泡剂，购自佛山 市南海大田化学有限公司; NB 培养基、NA 培养基、 LB 培 养 基、LA 培 养 基、发 酵 培 养 基 ( 葡 萄 糖 25. 0 g，蛋 白 胨 20. 0 g，MgSO4·7H2O 0. 8 g，KCl 1. 0 g，NaH2PO4 ·2H2O 2. 0 g，Na2HPO4 ·2H2O 4. 0 g， 水 1 000 mL，初始 pH 值为 6. 5) ，均自制。

1. 3 主要仪器

立式压力蒸气灭菌锅( YXQ－LS－100G 型) ，购自 上海博讯有限公司; 高速落地离心机( Sorvall·lynx· 6000 型) ，购自赛默飞世尔科技有限公司; 5 L 离位灭 菌玻璃发酵罐( BLBIO－ 5GJ 型) 、30 L 自动发酵罐 ( 30SJ 型) ，均购自上海百仑生物科技有限公司; 发电 机( W120 型) ，购自上海复宏机电有限公司; 溶氧电 极( OXYFEＲM FDA VP 225 型) 、pH 电极( EasyFerm Plus PHI K8 225 型) ，均购自天津恩耐德科技有限公 司; 低温恒温搅拌反应浴( DHJF－4020 型) ，购自郑州 长城科工贸有限公司; 全无油空气压缩机( VWYD－ 20 /0－8 型) ，购自鞍山佳朋压缩机有限公司; 储气罐 ( DY02－13－14H－00 型) ，购自上海东亚压力容器制造有限公司; 全自动电加热蒸气发生器( YN30－0. 7－ D 型) ，购自上海扬诺锅炉制造有限公司。

2 方法

改良二倍稀释法测 定抗菌肽效价，即离心取发酵上清液作为抗菌肽样 液，用无菌生理盐水进行逐步二倍稀释，以大肠杆菌 ATCC 53832 作为指示菌，采用琼脂扩散法测定各 个稀释倍数下抗菌肽发酵样液对大肠杆菌的抗菌特 性。各个稀释倍数下的抗菌肽发酵液样品中以出现 肉眼不可见抑菌圈为终点。原液抗菌肽效价( 单位 为 Au) = 2n×1 000 /40，其中 n 表示不出现可见抑菌 圈的二倍稀释次数，40 表示孔中加液体积( μL) 。建 立抗菌肽抗菌效价和抑菌圈面积之间的线性关系，最 后绘制出效价测定标准曲线。将发酵罐清洗干净后装入 发酵培养基，盖上上盖，装上 pH 电极和溶氧电极，夹 紧通气管路、进出水管路，并用锡纸包裹 pH 电极、溶 氧电极、消泡电极、搅拌器的顶部。检查完毕后，放入 灭菌锅中 115 ℃灭菌 30 min。灭菌完毕后取出发酵罐，连 接好冷却水管( 两进两出) 、出气管、进气管; 组装上 搅拌电机，插上消泡电极、温度电极、pH 电极和溶氧 电极; 连接好消泡剂补加管路

3 结果与分析

发酵上清液抗菌肽效价对数值和抑 菌圈面积呈现出良好的线性关系，其中 Ｒ2 = 0. 996 5， 曲线方程为: y = 0. 004 7x+1. 600 1，其中 x 为抑菌圈 面积( mm2 ) ，y 为效价对数值。若效价超过计算范围 则需要将样品进行稀释后测定。此方法操作简单、工 作量小、准确度高、便于批量检测。在 5 L 发酵罐最优发酵条件下，即发酵罐内发酵 液体积为 2. 0 L，发酵通气率( 即单位体积发酵液所 对应的通气量) 为 1. 00 L /( min·L) ，放大到 30 L 发 酵罐时，若其中发酵液体积为 20 L，则依据发酵通气 率不变，其通气量应为 20. 0 L /min，即1. 2 m3 / h。故 设定 30 L 发酵罐装液体积为 20 L，通 气 量 为 1. 2 m3 / h，搅拌速度为 180 r /min，罐压为 0. 05 MPa。0 ～ 12 h，随着发酵时间的推移，pH 值逐渐降低， 第 12 小时时达到最低值，为 5. 50。这个阶段菌体快 速繁殖生长，需氧量增加，pH 值降低; 随后 pH 值逐渐升高，菌群生长趋于稳定。

4 讨论与结论

采用 二 倍 稀 释 法 探 究 B． laterosporus S62－9 的胞外抗菌肽对 S．aureus 的抑制效果，发现抗 菌肽发酵样品的发酵对数值与抑菌圈直径存在线性 关系，其抗菌效价最高可达 8 000 Au。本试验中 T－ 70－1 菌株胞外抗菌肽的效价对数值与抑菌圈面积之 间存在线性关系，确定了原发酵液抗菌肽的效价，这 种方法既避免了人为主观影响，又解决了抗菌肽没有 标准品的难题。