紫杉醇聚酰胺聚合物胶束制备-博迅干燥箱的应用

紫杉醇( PTX) 从短叶红豆杉的树皮中分离得到而命名，其作用机制是具有独特的抗微管作用，促进 微管蛋白聚合及抑制微管的解聚，阻碍细胞内骨架 合成，从而干扰有丝分裂 。它主要用于治疗乳 腺癌、卵巢癌及非小细胞肺癌等 。PTX 是一种 疏水性药物 ，因此，提高溶解性是 PTX 制剂的首 要问题。目前，国内外市售 PTX 制剂中除注射用 PTX 脂质体( 力朴素) 为脂质体载体外，均为聚氧乙 烯蓖麻油与乙醇作为溶媒制剂，其中聚氧乙烯蓖麻 油具有肾毒性、变态反应和神经毒性等不良反应，应 用受到很大影响。另外，PTX 作为细胞毒性的抗肿 瘤药物，因为缺乏肿瘤靶向性，甚至导致全身性毒性 ，特别是中性粒细胞减少症等免疫性疾病，这 使得其临床应用受到很大限制。

1 材料与方法

1. 1 试剂和仪器

十八胺、N，N-二甲基甲酰胺、甲 酰胺、N，N-二环己基碳二亚胺、FA、HA、1-( 3-二甲氨 基丙基) -3-乙基碳二亚胺均购自麦克林; 硼酸购自 天津市恒兴化学试剂制造有限公司; 十水合四硼酸 钠、二甲基亚砜均购自国药集团化学试剂有限公司; NH2-PEG2000-COOH、透析袋均购自北京索莱宝科 技有限公司; PAMAM 购自威海晨源分子新材料有 限公司; PTX 购自大连美仑生物技术有限公司。仪 器为 H-J 磁力加热搅拌器( 巩义市裕华仪器有限责 任公司) ，PH400 基础型酸度计( 安莱利斯有限公 司) ，TY96-11IV 超声波细胞粉碎机( 宁波新艺生物 科技葛粉有限公司) ，高速冷冻离心机( Thermo) ，电热鼓风干燥箱( 上海博迅有限公司) ，GOLD-SIM 冷 冻干燥机( 美国金西盟国际集团) ，透射电镜( TEM) ( 日立) ，动态光散射( DLS) ( 美国布鲁克海文仪器 公司) 。

1. 2 PAMAM 荧光标记物的制备

利用 PAMAM 的氨基末端与异硫氰酸荧光素的异硫氰基可以共价 结合 的 化 学 反 应，制备荧光标记物。称 取 适 量 PAMAM，溶于磷酸盐缓冲液( PBS，pH7. 4) 中，缓慢 滴加异硫氰酸荧光素的丙酮溶液。摩尔比为 PAMAM ∶异硫氰酸荧光素= 1 ∶1. 2。避光磁力搅拌 36 h， 透析袋中透析 3 d，离心除去未反应的异硫氰酸荧光 素，冻干得到异硫氰酸荧光素标记的 PAMAM 聚合 物。异硫氰酸荧光素在 488 nm 激发波长下，显示特 征绿色荧光。

1. 3 PAMAM-PEG 的合成

称取硼砂 1. 895 3 g、硼酸 1. 235 7 g 溶于 1 L 蒸馏水中，得到 pH8. 0 的缓 冲溶液，避光保存。将 PAMAM 2. 079 6 g 和 PEG 0. 141 0 g 溶于 20 ml 硼砂-硼酸缓冲液中，室温，避 光，磁力搅拌 12 h( 转速为 1 000 r/min) 。将反应混 合物转移至 50 kD 截留分子量的超滤管中超滤，转 速为 4 000 r/min，30 min /次，共超滤 7 次，收集上层 液体，放入－20℃ 冰箱冷冻保存，后放入冷冻干燥机 中冻干，冻干后称重、密封保存，备用。

1. 4 HA-C18 的合成

称取 HA 100 mg，溶于甲酰 胺 20 ml，50℃ 水 浴 加 热，磁 力 搅 拌 ( 转 速 为 1 000 r/min) 直 至 完 全 溶 解，冷 却 至 室 温。加 入 1-( 3-二 甲 氨 基 丙 基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐 480 mg，N-羟基琥珀酰亚胺 290 mg，冰浴磁力搅拌 ( 转速为1 000 r/min) 2 h，充分反应，得到混合物 1。 称取十八烷胺 30 mg，溶于 15 ml 无水二甲基甲酰胺 中，充分溶解后，缓慢滴加至上述混合物 1 中，两者 混合液在 60℃氮气环境下搅拌 5 h，然后在氮气环 境下室温搅拌 24 h。将上述反应液转移至透析袋中 ( 截留分子量 7 000 D) 在水/乙醇( V /V，等容积比) 1 000 ml中透析 24 h，然后将透析过的上述混合液 在蒸馏水中透析 24 h。所得混合物离心除去不溶杂 质，将所得液体放入－20℃ 冰箱冷冻保存，然后放入 冷冻干燥机中冻干后称重、密封保存，备用。

1. 5 FA-HA-C18 的合成

称取 FA 102. 3 mg，溶于 30 ml 二甲基亚砜中，使其充分溶解。称取二环己 基碳二亚胺 92 mg，N-羟基琥珀酰亚胺 33 mg，加入 上述液体中，室温避光活化反应 5 h。将上述 HAC18 用 15 ml 无水甲酰胺溶解，将 FA-N-羟基琥珀酰 亚胺-二环己基碳二亚胺滤液缓慢滴入上述含 HAC18 的无水甲酰胺溶液中，避光，磁力搅拌( 转速为 1 000 r/min) 48 h。将反应后的 FA-HA-C18 反应液 转移至透析袋中( 截留分子量 7 000 D) 在 NAHCO3- NA2CO3 缓冲液( NAHCO3 3. 34 g 和 NA2CO3 1 g 定 容至 1 L 双蒸水中) 中透析 24 h。将透析过的上述 混合液，在蒸馏水中透析 24 h。所得混合物离心除 去不溶杂质，将所得液体放入－20℃ 冰箱冷冻保存， 放入冷冻干燥机中冻干后称重、密封保存，备用。

2 结 果

用磁共振氢谱( 1 H-NMＲ 谱) 对合成所得产物的结构进行表征， PTX、PAMAM-PEG、FA-HA-C18 的特征峰说明成功地将三组分引入到 PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18 结构中。见图 1。

胶束的 PTX 载药量 为 18. 50%，包封率为 50. 13%。图 2 可见，胶束为结 构规整、分散性好、粒径较均一的球形胶束。另外， 从 DLS 测定结果中，还可得出胶束的平均粒径约为 329 nm。将胶束加入乙腈中， 探头超声使得胶束结构被充分破坏，过微孔滤膜，分 别于 0，1，2，4，6，8，12 h 收集续滤液，记录其峰面积 分 别 为 3 672 301. 750、 3 532 999. 750、 3 618 709. 750、3 560 782. 875、3 568 750. 025、 3 626 341. 438、3 545 328. 250 μV · s，平 均 3 589 316. 263 μV·s，相 对 标 准 偏 差 ( ＲSD ) 为 1. 41%。在 12 h 内峰面积稳定，表明胶束稳定性 较好。

3 讨 论

分子物质和脂质在肿瘤组织透过性增强及滞留效应 称 作 实 体 瘤 的 高 通 透 性 和 滞 留 效 应 ( EPＲ)  ，EPＲ 促进了大分子类物质在肿瘤组织 的选择性分布，可以增加药效并减少系统副作用，本 研究基于 EPＲ 原理，将高分子聚合物与小分子化疗 药物的耦联物，通过药剂学手段结合到高分子材料 表面。PAMAM 是一类目前得到广泛应用的树枝状 聚合物材料 ，其本身能物理包埋或化学结合小分子药物，其表面的官能团还能连接多种对机体某些 器官、组织和细胞有特异性相互作用的靶向配基，从 而将包封或者耦联的药物带到病变部位实现主动靶 向治疗。