上海博迅培养箱用于细胞株的建立

microＲNA 是一类广泛存在于真核生物中不编码 蛋白质的短序列 ＲNAs 分子，在体内通过与靶基因的 3 ＇端非编码区特异性结合，形成 ＲNA 诱导复合体，下调 相应蛋白质的表达水平。目 前 多 项 研 究 发 现miＲ-125b 可通过调控靶基因转录因子、基质金属蛋白 酶、Bcl-2 家族成员等，与肿瘤、免疫性疾病、血液系统 及心血管疾病等的发生发展密切相关。

1 材料与方法

1． 1 实验材料

Jurkat T 细胞株及 293T 细胞株均购 自中国科学院昆明动物研究所。

1． 2 实验试剂

hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒过表达载体 ( mimic) 、hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒过表达载体阴性对 照( mimic-nc) 、hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干扰载体( inhibitor) 、hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干扰载体阴性对照 ( inhibitor-nc ) ，美 国 GeneCopoeia 公 司，Lipofectamine 2000 转染试剂( 美国 Invitrogen 公司) ，DH5α 感受态细 胞( 日本 Takara 公司) ，无内毒素质粒大提试剂盒( 北 京天根生化科技有限公司) ，胎牛血清( 美国 Gibco 公 司) ，DMEM 培养基、ＲPMI 1640 培养基( 美国 Hyclone 公司) ，Ｒneasy MiNi Kit ( 德 国 Qiagen 公 司) ，All-inOneTM miＲNA qＲT-PCＲ Detection Kit、All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit ( 美 国 GeneCopoeia 公 司) ，ＲIPA Buffer、Protease Inhibitor Cocktail( 美国 SIGMA 公司) ，β-actin 抗体、UVＲAG 抗体、goat anti-rabbit IgG-HＲP( 美国 Santa Cruz 公司) 。

1． 3 实验仪器

7500 型快速实时荧光定量 PCＲ 仪 ( 美国 ABI 公司) ，普通 PCＲ 仪( 深圳市赛泰克生物科技有限公司) ，垂直电泳仪和膜转印装置、凝胶成像系 统( 美国 Bio-rad 公司) ，细胞培养箱( 美国 Thermo 公 司) ，微量核酸浓度测定仪( 美国 Thermo 公司) ，台式 冷冻离 心 机( 美 国 Thermo 公 司) ，低 速 离 心 机 ( SC3616，安徽中科中佳科学仪器有限公司) ，上海博迅BSC-1300B2生物安全柜 ，普通倒置 显微镜、荧光倒置显微镜( 日本 Olympus 公司) 。

1． 4 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒载体及包装质粒转化至 大肠杆菌中及扩增

采用 CaCl2 法将 miＲ-125b-5p 慢 病毒载体及包装质粒转化至 DH5α 大肠杆菌，挑选氨 苄青霉素抗性的单个菌落进行扩增培养，无内毒素质 粒大提试剂盒提取质粒，行琼脂糖凝胶电泳观察及 摄像。

1． 5 细胞复苏与培养

液氮中取出 Jurkat T 细胞及 293T 细胞，37 ℃ 水浴化冻，Jurkat T 细胞加入含 10% 胎牛血清、1% PS 的 ＲPMI 1640 培养基，293T 细胞加入 含 10% 胎牛血清、1% PS 的 DMEM 培养基，置于37 ℃、 5% CO2 培养箱中孵育，当细胞生长至约 90% 密度时 传代。

1． 6 慢病毒包装

转染前 24 h 取对数生长期的 293T 细胞进行传代，加入无抗菌药物的含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，待细胞贴壁生长达 70% 融合时，按照 脂质体 Lipofectamine 2000 说明书将 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒过表达载体或 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干扰载 体及相应对照载体和 psPAX2、pMD2． G 共同组成慢病毒包装系统转染 293T 细胞，置于 37 ℃、5% CO2 培养 箱中孵育 24 h 后弃上清，加入含 10% 胎牛血清、1% PS 的 DMEM 培养基培养 48 h。荧光倒置显微镜观察 293T 细胞的荧光表达情况，收集富含慢病毒颗粒的细 胞上清液，3 000 r/min 离心 10 min，离心半径 9 cm，去 除沉淀。

2 结 果

琼脂糖凝胶电泳显示 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒 过表达载体及对照，hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干扰载体 及对照，慢病毒包装质粒 psPAX2、pMD2． G 与理想大 小相符合，可用于转染 Jurkat T 细胞。利用慢病毒载体与包装质粒( psPAX2、pMD2． G) 共同转染 293T 细 胞，荧光倒置显微镜观察 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒过表 达载体及对照载体组 293T 细胞均可见大量的绿色荧 光，hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干扰载体及对照载体组 293T 细胞均可见大量的红色荧光。利用成功包装 的慢病毒颗粒感染 Jurakat T 细胞，荧光显微镜观察 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒过表达载体及对照载体组的 Jurkat T 细胞内均有明亮的绿色荧光表达。hsa-miＲ125b-5p 慢病毒干扰载体及对照载体组的 Jurkat T 细 胞内均有明亮的红色荧光表达。和对照载体组比较，hsa-miＲ-125b-5p 慢 病毒过表达载体组 miＲ-125b-5p 表达水平明显增高 ( P ＜ 0． 01) ，hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干扰载体组 miＲ125b-5p 表达水平明显降低( P ＜ 0． 01) ，差异均有统计 学意义，见图 1。

3 讨 论

miＲ-125b-5p 属于 miＲ-125 家族，miＲ-125 包括 hsamiＲ-125a 及 hsa-miＲ-125b 两个亚家族，其中转录 miＲ125a 的基因位于染色体 19q13 上，而 miＲ-125b 由染色 体 11q23 和 21q2 两个位点转录并分别形成 miＲ-125b-1 和 miＲ-125b-2。共 包 含 5 个 成 熟 体 miＲNA: miＲ125a-3p、miＲ-125a-5p、miＲ-125b-1-3p、miＲ-125b-2-3p 和 miＲ-125b-5p，其中 miＲ-125b-5p 和 miＲ-125a-5p 的碱基 序列高度相似，miＲ-125b-1-3p 和 miＲ-125b-2-3p 的碱基 序列高度相似。miＲ-125 的表达具有高度保守性及广泛 性。miＲ-125 家族最早由 Lagos-Quintana M 等于 2002 年在小鼠中发现并测序。2005 年 Lee Y S 等首次对 miＲ-125b-5p 的功能进行报道，发现其是分化的肿瘤细 胞增殖过程中的关键因子。至目前为止，已有大量研究 证实其在细胞凋亡、细胞增殖和分化、肿瘤抑制、 线粒体生物合成、细菌感染等病理生理过程中的 作用，其差异性表达也和多种疾病如急性心肌梗死、 多发性骨髓瘤、急性缺血性中风、肝细胞癌、骨 关节炎等有关。



 

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