博迅分析复氧损伤心肌细胞的机制

冠心病( CHD) 是冠状动脉血管发生动脉粥样 硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、 缺氧或坏死而导致的心脏病。临床上主要有药 物治疗、经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移 植术; 但是在恢复心肌血流的同时，由于氧自由基大 量产生，导致心肌凋亡通路激活，可能会加重心肌细 胞结构 及 功 能 的 损 伤，即 心 肌 缺 血/再 灌 注 损 伤 ( MI /ＲI) 。MI /ＲI 降低了缺血性心脏病的治疗效 果，增加了患者负担。因此，寻找有效的方法防治 MI /ＲI 成为亟待解决的问题。

1 材料

1. 1 细胞

大鼠子一代 H9c2 心肌细胞，购于上海子实生物科技有限公司。

1. 2 药物与试剂

瓜蒌皮药材收集于河北省安国 市，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴 定为葫芦科植物栝楼的干燥成熟果皮; Na2 S2O4 ( 美 国百灵威科技有限公司，纯 度 85% ) ; NO，eNOS， iNOS 酶联免疫吸附测定( ELISA) 试剂盒( 上海联硕 科技有限公司，批号均为 201804) ; 兔抗大鼠 Akt，磷 酸化( p) -Akt( Ser 473) ，eNOS，iNOS，甘油醛-3-磷酸 脱 氢 酶 ( GAPDH ) 抗 体 ( 美 国 Cell SignalingTechnology 公司，批号均为 BC18AA0047) ; 辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白( Ig) G 二抗，牛血 清白蛋白( BSA) ( 上海碧云天生物技术有限公司， 批号分 别 为 B0802，P2300 ) ; 噻唑 蓝 ( MTT) ，SDSPAGE 凝胶制备试剂盒( 北京索莱宝科技有限公司， 批号分别为 CA1020，P1200) ; 二甲基亚砜( DMSO， 美国 Sigma 公司，批号 201806270285) ; DMEM 高糖 培养基，胎牛血清( FBS) ，0. 25% 胰蛋白酶( 美国 Gibco 公司，批号均为 G18032) ; 1% 青霉素-链霉素 双抗、磷酸盐缓冲液( PBS) ( 美国 Hyclone 公司，批 号分 别 为 J180012，J170035 ) ; 细胞 裂 解 液，EZ-10 DNAaway ＲNA 小量提取试剂盒，PCＲ 引物，动物全 蛋白提取试剂盒［生工生物工程( 上海) 股份有限公 司，批 号 分 别 为 D612002，B518651，B662204， 600530-53］; ProtoScript  Ⅱ 反转 录 试 剂 盒 ( 美 国 NEB 公司，批号 0041509) ; 聚偏二氟乙烯( PVDF) 膜 ( 美国 Merck Millipore 公司，批号 421302) ; BCA 蛋 白浓度测定试剂盒，ECL 化学发光试剂盒( 上海碧 云天生物技术有限公司，批 号 分 别 为 P0007， N1410) ; 实验用水为超纯水。

1. 3 仪器

Thermo HEＲAcell 150i 型 CO2 细胞培 养箱，NanoDrop 2000 型超微量分光光度计( 美国 Thermo Scientific 公司) ; MＲ18. 22 型超速低温离心 机( 法国 Jouan 公司) ; CP225D 型微量电子天平( 德 国 Sartorius 公司) ; Infinite M200 型多功能酶标仪 ( 瑞士 Tecan 公司) ; BD FACSVerse 型流式细胞仪 ( 美国 BD 公司) ; Stratagene Mx 3000P 型实时荧光 定量聚合酶链式反应 ( Ｒeal-time PCＲ) 仪 ( 美 国 Agilent 公司) ; JY200C 型电泳仪( 北京君意电泳设 备有限公司) ; Tanon-5200 型凝胶成像系统( 上海天 能科技有限公司) 。

2 方法

2. 1 药物制备及溶液配制

称取干燥的瓜蒌皮粉 末 100. 0 g，加入蒸馏水 1 000 mL 浸泡 30 min，煎煮 2 h，8 层纱布过滤。滤渣重复提取 2 次，合并滤 液，减压浓缩至 100 mL，再经真空冷冻干燥，即得样 品( 得率为 19. 5% ) ，于 4 ℃保存备用。 精密称取干燥的瓜蒌皮水提物 20. 0 mg，溶于 DMEM 高糖培养基中，配制成 2. 0 g·L － 1的储存液， 0. 22 μm 滤器过滤除菌，置于 4 ℃ 冰箱备用。根 据后续的实验需求，以 DMEM 高糖培养基稀释成相 应终质量浓度( 50 mg·L － 1 ) 。 精密 称 取 Na2 S2O4 30. 72 mg，溶于 PBS 溶 液 15. 0 mL 中，配成 10 mmol·L － 1 Na2 S2O4 储备液，再用 PBS 稀释成规定浓度，避光，现用现配。

2. 2 细胞培养

取 H9c2 心肌细胞，用含 10% FBS， 1% 双抗的 DMEM 高糖培养基( 以下简称培养液) 于 37 ℃ 5% CO2 的细胞培养箱中培养( 以下培养条件 相同) ，适时换液。当细胞覆盖率达到 80% 以上时， 即可进行传代。传代至第 5 代时，取对数生长期细 胞进行实验。在每次实验前，吸弃各培养瓶中的培 养液，换 0. 5% FBS 的培养液“饥饿”12 h，进行心肌 细胞同步化处理。

2. 3 细胞造模、分组及给药

根据文献报道及前期 实验工作，心肌细胞的缺氧/复氧模型按照 2. 2 项下方法培养细胞。将培养液吸出，用 PBS 洗涤对 数生 长 期 细 胞 1 ～ 2 次 后 换 上 2. 5 mmol·L － 1 Na2 S2O4 溶液，置于 37 ℃ 5% CO2 95% 空气细胞培 养箱内 30 min，造成细胞缺氧; 再将缺氧培养基换成 培养液置于 37 ℃ 5% CO2 95% 空气细胞培养箱内 4 h，使细胞复氧。 根据前期瓜蒌皮提取物给药剂量的筛选及预实验，按照 2. 2 项下方法培养细胞，随机分为正常 组: 正常培养，不进行缺氧复氧处理; 模型组( H /Ｒ 组) : 细胞缺氧 30 min，复氧 4 h; 瓜蒌皮提取物组 ( 50 mg·L － 1 ) : 药物 预 孵 育 24 h，然 后 造 成 缺 氧 30 min，复 氧 4 h; 抑 制 剂 组 ( LY294002， 10 μmol·L － 1 ) : 抑制剂与瓜蒌 皮提取物 ( 50 mg·L － 1 ) 共 同 预 孵 育 24 h，然 后 造 成 缺 氧 30 min，复氧 4 h。

2. 4 各组细胞活力的检测

按照 2. 2 项下方法培养 细胞。取对数生长期的心肌细胞，以 1 × 105 个/mL 的密度接种于 96 孔板，每孔 100 μL，按照 2. 3 项下 方法进行随机分组、给药预处理及造模。复氧后，根 据 MTT 说明书，处理结束后的各组细胞每孔加入 MTT 溶液( 5 g·L － 1 ) 20 μL，避光孵育 4 h; 吸去培养 液，加入 DMSO 150 μL 涡旋振荡 10 min，使结晶充 分溶解; 用酶标仪在 570 nm 波长处测定吸光度 A。 另设空白组，加入相应量培养液和 MTT，DMSO 试剂 但不加入细胞。每种处理设 6 个复孔，实验重复 3 次。根据以下公式计算存活率。 细胞存活率 = ( A1 － A0 ) /( A2 － A0 ) × 100% 式中 A1 是实验组的吸光度; A2 是正常组的吸 光度; A0 是空白组吸光度。

2. 5 ELISA 检测

各 组 细 胞 NO 释 放 量 及 eNOS， iNOS 活 性 水 平 取对数生长期细胞，以 1 × 105 个/mL的密度接种于 24 孔板，每孔 0. 5 mL。按 照 2. 3 项下方法进行随机分组、给药预处理及造模。复氧后，取各组心肌细胞上清液按试剂盒说明书检 测 NO 释放量; 预冷 PBS 洗涤细胞后加入细胞裂解 液，30 min 后收集细胞裂解液，按试剂盒说明书检测 eNOS，iNOS 的活性水平。

3 结果

与正 常组比较，心肌细胞经缺氧/复氧后，细胞存活率显 著降低( P ＜ 0. 01) ，表明缺氧/复氧模型复制成功。 50 mg·L － 1瓜蒌皮提取物单独预处理后，与模型组比 较，细胞存活率升高; 与 50 mg·L － 1瓜蒌皮提取物组 比较，PI3K 特异性抑制剂 LY294002 预处理后抑制 了细胞活性( P ＜ 0. 01) 。与正常组比较，模型组细胞中 NO 释放量， eNOS 水平均显著降低( P ＜ 0. 01) ; 与模型组比较， 50 mg·L － 1瓜蒌皮提取物单独预处理 24 h 后，NO 含 量，eNOS 水 平 显 著 升 高 ( P ＜ 0. 01) ; 抑 制 剂 LY294002 预处理后，在相同浓度的瓜蒌皮水提物预 处理条件下 LY294002 ( + ) 和 LY294002 ( － ) 组之 间比较，NO 含量和 eNOS 活性水平均明显降低( P ＜ 0. 05) ; 而各组细胞 iNOS 的活性水平与 eNOS 的变 化趋势相反。与正常组比较，模型组细胞 中 Akt，p-Akt，eNOS 的蛋白表达水平显著降低， p-Akt /Akt 显 著 降 低 ( P ＜ 0. 01 ) ; 与模 型 组 比 较， 50 mg·L － 1瓜蒌皮提取物单独预处理 24 h 后，Akt， p-Akt，eNOS 的蛋白表达水平都升高，p-Akt /Akt 显 著上升( P ＜ 0. 01) ; 抑制剂 LY294002 预处理后，在 相同浓度的瓜蒌皮水提物预处理条件下 LY294002 ( + ) 和 LY294002 ( － ) 组 之 间 相 比，Akt，p-Akt， eNOS 的蛋白表达水平均降低，p-Akt /Akt 下降( P ＜ 0. 01) ; 而各组细胞 iNOS 的蛋白表达水平与 eNOS 的变化趋势相反。

4 讨论

心肌缺血、缺氧可导致心肌代谢功能异常和结 构破坏，从而引发胸痛或胸部不适，属中医“胸痹” “真心痛”的范畴。临床上主要采用药物治疗 法、经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植术 等治疗心肌缺血; 但是在心肌血流恢复的同时，由于 氧自由基大量产生，导致心肌凋亡通路激活，可能会 加重心肌细胞结构及功能的损伤，即心肌缺血再灌 注损伤( MI /ＲI) 。由于诱发 MI /ＲI 的原因较为复杂，涉及到氧化应激、细胞凋亡、钙超载和能量代 谢等，目前尚未发现安全有效的治疗方法。因 此，寻找有效的药物来预防和治疗心肌缺血性疾病 对于临床实践有着重要的意义。