地表水耐热大肠菌群测定分析！！！

耐热大肠菌群是在 44. 5 ℃ 仍能正常生长并发 酵乳糖产酸产气的大肠菌群，主要来自粪便，是当前 国内外环境监测部门评价水体污染程度的重要监测项目之一，具有广泛的卫生学意义。因此，选择 精确、快速、可靠的耐热大肠菌群检测方法，准确及 时地监测水体受粪便污染的状况，对预防和控制流 行疾病的发生与传播有科学意义。

1 材料与方法

1．1 水样

选取广州市主要水源地及水源调查点采集的 51 份水样，按照《生活饮用水标准检验方法 水样的 采集与保存》( GB /T 5750. 2—2006) 的规定采集，并 于 0～4 ℃低温避光保存，4 h 内进行分析。

1．2 材料和仪器

质控样品( IDEXX) : 货号 MIC-QC6#D0 718 M; 乳糖蛋白胨培养液( HKM) ; EC 肉汤( HKM) ; 伊红 美蓝 琼 脂 培 养 基 ( HKM ) ; MMO-MUG 培 养 基 ( IDEXX) ; 97 孔无菌定量盘( IDEXX) ; 100 mL 无菌采样瓶 ( IDEXX) ; 定量封口机 ( IDEXX) ，( 44. 5 ± 0. 5) ℃恒温培养箱( BINDEＲ) ，( 36±1) ℃ 恒温培养 箱( BINDEＲ) ，立式压力蒸汽灭菌器( 上海博迅YXQ-75SII立式压力蒸汽灭菌器（非医用）) 。

1．3 方法

1．3．1 多管发酵法

参照《生 活 饮 用 水 标 准 检 验 方 法》( GB /T 5750. 12—2006) 中 3. 1 节。
( 1) 初发酵试验: 取 10 mL 水样接种到 10 mL 双料乳糖蛋白胨培养液中，取 1 mL 水样接种到 10 mL 单料乳糖蛋白胨培养液中，另取 1 mL 水样注入 9 mL 生理盐水中，混匀后吸取 1 mL 接种到 10 mL 单料 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 中。 将 接 种 管 置 于 ( 36±1) ℃培养箱培养( 24±2) h，产酸和产气的发酵 管表明试验阳性。
( 2) 复发酵试验: 轻微振荡初发酵试验阳性结 果的发酵管，用灭菌棒将培养物转接到 EC 培养液 中，在( 44. 5±0. 5) ℃ 培养箱培养( 24±2) h。如所有 管均不产气，则可报告为阴性; 如有产气者，则转种 于伊红美蓝琼脂平板上，置( 44. 5±0. 5) ℃ 培养18～ 24 h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌 群阳性。
( 3) 计算和报告结果: 根据不同接种量发酵管 所表现阳性结果的数目，查最可能数 ( MPN) 检索 表，报告每 100 mL 水样中的耐热大肠菌群最可能数 ( MPN) 值。

1．3．2 固定酶底物法

参照《水质 耐热大肠菌群的测定 酶底物法》 ( DBJ440100 /T 276—2016) 。 ( 1) 用 100 mL 无菌稀释瓶取 100 mL 水样，加 入( 2. 7±0. 5) g MMO-MUG 培养基粉末，混摇均匀， 使之完全溶解，将水样全部倒入 97 孔无菌定量盘 内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用 程控 定 量 封 口 机 封 口。将 定 量 盘 放 入 ( 44. 5 ± 0. 5) ℃培养箱中培养 24 h 后进行结果判读: 孔内水 样变成黄色表示该孔内含有耐热大肠菌群。如结果 为可疑阳性，可延长培养时间到 28 h，超过 28 h 后 出现的颜色反应，不作为阳性结果。 ( 2) 结果报告: 计算有黄色反应的孔穴数，对照 97 孔定量盘法不同阳性结果的 MPN 检索表，查出 其代表的耐热大肠菌群最可能数( MPN) 。结果以 MPN/( 100 mL) 表示，如所有孔未产生黄色，则可报告耐热大肠菌群未检出。

1．4 数据统计

所得数据使用 SPSS 22 进行统计分析处理。

2 结果与分析

固定酶底物法、多管发酵法 3 次测定质控样品的平 均 值 分 别 为 147. 5 MPN/( 100 mL ) 和 170 MPN/( 100 mL) ，相 对 平 均 偏 差 分 别 为 8. 3% 和 9. 85%，精密度良好。两种方法检测结果均在质控 样品置信范围内［48. 0～498 MPN/( 100 mL) ］，接近 质控样品标准值［180 MPN/( 100 mL) ］，检测结果 可信度良好( 表 1) 。

水体中颗粒物可为微生物生长提供附着场所， 并通过包裹作用抵御紫外线的影响，因此，耐热大肠 菌群数量随着浊度升高而增大。依据监测站 常规监测数据，选取低浊度( ≤3 NTU) 水样 32 份， 分别用固定酶底物法和多管发酵法进行检测，结果 如图 1 所示。对数据进行相关性检验，结果显示: 相 关系数 r = 0. 824，P = 0. 000，表明两种方法检测结果 相关性趋于一致。对数据进行配对样本 t 检验，t = 0. 964，P = 0. 343，表明两种方法检测结果无显著性差异，可认为固定酶底物法与多管发酵法对 低浊度水样的检测效果一致。选取浑浊( ＞3 NTU) 水样 19 份，分别用固定酶 底物法和多管发酵法进行检测， 对数据进行相关性检验，结果显示: 相关系数 r = 0. 839，P = 0. 000，表明两种方法结果的相关性趋于 一致。对数据进行配对样本 t 检验，t = 1. 539，P = 0. 141，表明两种方法检测结果无显著性差异( 表 3) ，可认为固定酶底物法与多管发酵法对浑浊水样 的检测效果一致。

3 讨论

目前，在地表水耐热大肠菌群检测工作中大多 数采用多管发酵法，检测过程存在诸多问题。
( 1) 步骤相对繁琐复杂: 需要一系列前期准备 工作，配制培养基时试剂称量的准确性、pH 的范围、 高压消毒及培养基使用温度等诸多因素均会对最终 结果造成影响。
( 2) 检测时间长: 在初发酵有检出时还需经过 复发酵和伊红美蓝琼脂平板验证两个过程才能得出 耐热大肠菌群 MPN 值，培养时间至少需要 72 h，不 能对水体的卫生学状况作出快速评价。
( 3) 准确度: 多管发酵法操作重复接菌过程中，程序越多，引入的误差可能性越大，造成污染的几率 也较大，结果的可靠性也就越低。
( 4) 技术操作: 多管发酵法每一样品的发酵 管数、接种量有严格要求，需要对样品进行稀释， 稀释过程中的摇匀是测定结果准确度的重要因 素之一，不同人员操作误差较大，必要时还要对 可疑管进行确认试验，需要试验人员具备专业的 微生物知识，对试验环境的无菌程 度 要 求 也 比 较高。
( 5) 物料成本: 所用试剂综合成本为 10. 28 元/ 样品，但需考虑增加的人工成本和配备蒸汽灭菌器 及建设无菌实验室的成本。