上海一恒分析细胞迁移和侵袭的影响

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病 率和死亡率呈逐年上升趋势，发病率在恶性肿 瘤中排名第 4 位，死亡率居第 5 位。手术、放 疗、化疗为结直肠癌主要治疗方式，但毒副作用较 大，预后效果不佳，故寻找毒副作用较小的高 效药物具有重要意义。

1 材料

人正常结肠上皮细胞 NCM460、人结肠癌细胞 SW620 购自中国典型培养物保藏中心 ( CCTCC) 。 胎牛血清、ＲPMI-1640 培养基、二甲基亚砜 ( DMSO) 购自美国 Gibco 公司; 槲皮素、胰蛋白酶购 自北京索莱宝科技有限公司; BCA 试剂盒、PBS 缓 冲 液、 MTT 试 剂 盒 购 自 美 国 Sigma 公 司; Transwell 小 室 购 自 美 国 Corning 公 司; β-actin、 STAT3 一抗购自英国 Abcam 公司; HＲP 二抗购自 上海 碧 云 天 生 物 科 技 公 司; Trizol 试 剂、 Lipofectamine TM 2000、SDS-PAGE 试剂盒购自美 国 Invitrogen 公司; TaKaＲa 反转录试剂盒、荧光定 量试剂 盒 购 自 宝 生 物 工 程 ( 大 连) 有 限 公 司; PVDF 膜购自美国 Millipore 公司; ABI-7300 实时荧 光定量 PCＲ 仪购自上海普迪生物技术有限公司; NanoDrop 微量核酸测定仪购自美国赛默飞世尔科 技公司; 凝胶成像分析仪购自柯达公司。

2 方法

2. 1 细胞培养及转染

含 10%胎牛血清的 ＲPMI1640 培养基于 37 ℃、5% CO2 下培 养 NCM460、 SW620 细胞，每 2 d 换液 1 次，细胞汇合度达到 80%后用 0. 25% 胰酶消化并传代，待细胞生长状 态稳定后取对数生长期细胞用于后续实验。收集汇 合度约 50%的 SW620 细胞，按照 Lipofectamine TM 2000 转染试剂说明书 分别加入转染试剂 Lipofectamine 与 si-NC、 si-STAT3、 pcDNA、 STAT3，并依次标记为 si-NC 组、si-STAT3 组、槲 皮素+pcDNA 组、槲皮素+STAT3 组。

2. 2 给 药 及 分 组

DMSO 溶 解 槲 皮 素，配 成 20 mmol /L贮备 液，于 － 20 ℃ 下 保 存，使 用 时 用 ＲPMI-1640 培养液稀释，用于细胞培养。将其加入 到 SW620 细胞培养液中，槲皮素终浓度分别为 0、 25、50、100 μmol /L，重复 5 次，各组细胞置于上海博迅BPX-82电热恒温培养箱中，37 ℃、5% CO2 下 常 规 培 养 24 h， 50 μmol /L槲皮素处理的细胞分别培养 0、24、48、 72 h，每组重复 5 次。

2. 3 细胞存活率检测

采用 MTT 法。取槲皮素 0 μmol /L 组、 25 μmol /L 组、 50 μmol /L 组、100 μmol /L组，si-NC 组，si-STAT3 组细胞，在转 染后的槲皮素+pcDNA 组和槲皮素+STAT3 组细胞 培养液中加入槲皮素，调整终浓度为 50 μmol /L。 培养 24 h 后，各组细胞加入 20 μL MTT 孵育 4 h， 弃去 培 养 基，每 孔 加 150 μL DMSO，振 荡 溶 解 10 min，酶 标 仪 检 测 490 nm 波长处各孔光密度 ( OD) 值，计算存活率，公式为存活率= ( 实验组 OD 值/对照组 OD 值) ×100%。

2. 4 细胞迁移和侵袭检测

采用 Transwell 法。各 组细胞加入 2. 5 μg /mL 丝裂霉素 C 干预 24 h 以抑 制细胞分裂，培养结束后加入适量胰酶消化，PBS 缓冲液清洗后用无血清培养基重悬细胞，调整密度 为 3×104 /mL，取 200 μL 接种于包被、未包被基质 胶的小室中，放到含完全培养基的下室中常规培养 24 h，弃去多余培养基，PBS 缓冲液洗涤后加入 4%多聚甲醛固定 30 min，0. 1%结晶紫染色10 min， 显微镜观察并随机选取 6 个视野拍照，计数。

2. 5 STAT3 mＲNA 表达检测

采用 ＲT-PCＲ 法。 收集各组对数生长期的细胞，充分研磨后加入 Trizol 试剂提取总 ＲNA，NanoDrop 微量核酸测定仪 检测 ＲNA 纯度和浓度，凝胶电泳系统检测 ＲNA 完 整性。TaKaＲa 反转录试剂盒将 ＲNA 反 转 录 成 cDNA，按照 TaKaＲa 荧光定量试剂盒使用说明配 制反应体系，以 β-actin 为内参，置于 ABI-7300 实 时荧光定量 PCＲ 仪上进行扩增，每个样品重复 3 次，引物序列见表 1，采用 2－ΔΔCt 法进行分析

3 结果

与对照组 ( 0 μmol /L) 比较，50、100 μmol /L槲皮素处理后细胞存活率显著降低 ( P＜0. 05) ，考 虑到成本方面，选择 50 μmol /L; 与对照组 ( 0 h) 比较，50 μmol /L 槲皮素处理 24、48、72 h 后其存 活率也显著降低 ( P＜0. 05，P＜0. 01) ，考虑到效率 方面，选择 48 h。与对照组比较，槲皮素组 STAT3 蛋白表达显著下调 ( P ＜ 0. 05) ，而过表达 STAT3 后槲皮素+STAT3 组蛋白表达显著上调 ( P＜ 0. 05) ; 槲皮素组细胞存活率、迁移数目、侵袭数 目显著降低 ( P＜0. 05) ，而过表达 STAT3 后槲皮 素+STAT3 组生存、迁移、侵袭能力显著增强 ( P＜ 0. 05) 。



 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。