咸鳓鱼中微生物多样性分析（博迅灭菌锅使用）

咸鳓鱼是浙东地区的传统腌鱼制品，因其肉质鲜 美且具独特的“霉”香味而备受当地居民的喜爱。其加 工是以新鲜鳓鱼为原料，不去除鱼鳞、鱼鳃及内脏，经 3 次加盐腌制而成，加盐量通常在 30 %~50 %。腌鱼生 产过程实质上是一个复杂微生态体系在人为控制盐 度、发酵温度、湿度条件下，使微生物群落结构及功能 趋于人们期望的方向演化的过程。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

咸鳓鱼：购于舟山、宁波、杭州萧山水产品批发市 场，各采集 2 种样品，依次编号为 A（腌制 90 d，25 ℃开 放腌制）、B（-18 ℃冻藏）、C（室温 22 ℃摊放）、D（室温 22 ℃摊放）、E（室温 22 ℃摊放）、F（室温 22 ℃摊放）。除 舟山市场采集的 A 样品为商贩自制咸鳓鱼外，其余产 品均为东南亚进口咸鳓鱼。 2216E 培养基：青岛海博生物技术有限公司；DNA 提取试剂盒：北京庄盟生物科技有限公司；E.Z.N.A. R Stool DNA Kit、Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker：TaKaRa 宝成试剂有限公司。

1.2 主要仪器

超净工作台 SW-CJ-1CU、蒸汽压力灭菌锅 YXQSG46-280SA：上海博讯实业有限公司；高速冷冻离心 机 5810R：英国艾本德公司；超微量分光光度计 MN913、高速聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）仪 A24811：美国赛默飞世尔公司；凝胶电泳系统 Tanon EPS600、凝胶成像系统 Tanon 4200：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

采集鳓鱼鳃后部、背部及腹部肉，剪碎混匀。同种 样品挑选体态大小一致、个体完整的 3 尾鱼，将其鱼肉 混匀，称取 25 g 鱼肉样品至含 225 mL 生理盐水的锥 形瓶中，震荡混匀后制备梯度稀释液，并涂布于 2216E 培养基。选择适宜的稀释度进行菌落计数，并随机挑 取 40 个菌落，纯化 2 次~3 次后，接种于相应的液体培 养基中，静置培养 24 h~48 h，制备 30 %的甘油菌液， -80 ℃冻藏备用。取 2216E 肉汤活化好的菌液 2 mL，按照试剂盒说 明书操作，提取菌株基因组 DNA。参考袁开等方法， 对分离菌株 16S rDNA 序列进行扩增，扩增产物测序 工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，基因序列 于 GenBank 中进行 BLAST 比对分析，部分序列结果提 交至 NCBI Genebank 数据库。

2 结果与分析

采用 2216E 培养基对各样品中可培养微生物进 行了计数与分离，咸鳓鱼样品在 2216E 培养基上的菌落数量集中分布于 4.9 log CFU/100 g~5.2 log CFU/100 g。 每组样品随机挑取 40 个菌落，经两次纯化后，从 A、C、 D、E、F 组样品中共分离到 151 株可培养菌 （B 组样品 微生物传代后均未生长）。分离菌株经过提取基因组、 扩增获得 16S rDNA 序列，测序结果经与美国国立生 物技术信息中心（National Center for Biotechnology In－ formation，NCBI）数据库比对分析，将其鉴定至种、属 水平，具体结果见表 3。将部分序列提交至 Genebank 数据库，获取序列编号为 MK205156~MK205178。芽孢杆菌属是一类广泛分布在土壤和水圈中的 细菌，在海洋环境中有大量分布。市售咸鳓鱼中的芽 孢杆菌属细菌，可能来源于鳓鱼自身的生存环境，也 可能在加工或保藏中混入。通常情况下，添加米饭等 淀粉质原料的发酵鱼制品生产中，芽孢杆菌属细菌会 成为优势菌，并且具有较为丰富的多样性。在高盐 腌制海产品中，枯草芽孢杆菌仅可能少量存在于产品 中。A、D、E、F 组样品中，枯草芽孢杆菌数量占据绝对 优势。咸鳓鱼加工原料中未加入淀粉质原料，且加盐 量达鱼体重的 30 %~50 %，因此，大量的芽孢杆菌可能 来源于生产后的贮藏或运输中。

3 讨论

基于分离培养研究技术从市售咸鳓鱼中获得 151 株可培养微生物，16S rDNA 序列分析显示，分离菌株 可归至 14 个属和 23 个种。芽孢杆菌属细菌是 A、D、 E、F 组样品中优势微生物；C 组样品中葡萄球菌为优 势菌，嗜冷杆菌和芽孢杆菌数量次之。上述 3 个属以 外的其他种属细菌在各类样品中均呈零星分布的状 态。然而，免培养高通量测序结果在属水平上反映出 的微生物种类与分离培养方法不尽相同。Illumina MiSeq 测序结果显示，C、D、E、F 组 中 狭 义 梭 菌 属 （Clostridium sensu stricto）和分类梭菌科（Clostridiaceae unclassified）微生物数量最多是其中的主要优势菌，而 A 组样品中碱杆菌属 （Alkalibacillus）、嗜盐古生菌 （Natrinema） 几乎占据了主导地位，B 组样品则以慢性 芽孢杆菌属（Lentibacilus）为主。



 

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