木瓜蛋白酶的失活机理研究（博迅GZX-9246MBE使用）

1 背景

目前，纸塑铝复合食品包装材料是以食品专用纸 板为基料，由聚乙烯、纸、铝箔等复合而成的纸质包 装材料。因其包装的便利性，纸塑铝复合食品包装材 料被广泛应用于液态乳制品、植物蛋白饮料、果汁饮 料、酒类产品以及饮用水等领域，但原材料中的塑料 以及印刷油墨、胶黏剂含有的重金属残留物通常会迁移到包装产品中，对产品造成污染并损害消费者 健康。此外，我国已经研发了多种以动植物为原料 的可食性包装材料，并广泛应用于各类食品包装。但 环境污染致使动植物体内积蓄铅、砷、镉和汞等重金 属，这也给可食性包装材料的应用带来了安全隐患。 因此，研究重金属与生物大分子间的相互作用机理及 重金属毒理分析，对拓展食品包装材料的应用领域至关重要。

2 实验部分

2.1 实验试剂及仪器设备

1）主要试剂 木瓜蛋白酶 [EC 3.4.22.2]（生物试剂）、对氯汞 苯甲酸（化学纯），美国 Sigma 公司；酪蛋白，生 物试剂，上海伯乐奥生物科技有限公司；三氯乙酸、 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，化学纯，上海国药集团化 学试剂有限公司；去离子水，实验室自制。
2）主要仪器与设备 集热式恒温加热磁力搅拌器，DF-101S 型，河 南巩义市予华仪器有限责任公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅GZX-9246MBE 型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电子分析天平，AL204 型，梅特勒 - 托利多仪器（上海）有限公司；同步辐射紫外真空 圆 二 色（synchrotron radiation circular dichroism， SRCD）光谱仪、同步辐射装置（Beijing synchrotron radiation facility，BSRF）、4B8 真空紫外线站（vacuum ultraviolet，VUV），中国科学院高能物理研究所； 荧 光 光 谱 仪，LS-55 型， 美 国 珀 金 埃 尔 默 公 司； Materials Studio 材料模拟计算平台，北京创腾科技有 限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 溶液的配制

木瓜蛋白酶和对氯汞苯甲酸用 pH=7.0 的磷酸盐 （phosphate buffered saline，PBS）缓冲液分别配成质 量浓度为 1 mg/mL 木瓜蛋白酶溶液和浓度为 1×10-4 mol/L 的 CMBA 溶液。 将 1 mL 的木瓜蛋白酶溶液与 1 mL CMBA 溶液 混合，放入 40 ℃集热式恒温加热磁力搅拌器中，调 节转速为 150 r/min，搅拌 4 h，以形成均匀的混合物， 用于 SRCD 及荧光光谱测定。

2.2.2 SRCD 分析

测定参数设置如下：环境温度 25 ℃，光径 0.1 mm，储存环的电子能量 1.5 GeV，束流强度 450 mA，分辨率 1.0 nm，扫描范围 172~260 nm，停留时 间 1 min。每组样品测定 5 次，取平均值，记录数据。 2.2.3 荧光光谱分析 测定参数设置如下：环境温度 25 ℃，激发波 长 280 nm，激发与发射的狭缝宽度均为 5 nm，扫 描速度 500 nm/min，扫描范围 310~400 nm。每组样 品测定 5 次，取平均值，记录数据。所得数据通过 CDTool 软件处理，并用 CDPRO 分析软件计算蛋白 质的二级结构，CD 信号范围为 -1.8×10-2 ~1.8×10-2 deg·cm2 ·dmol-1 ，蛋白质的相对分子质量为 110 Da。

2.3 分子模拟

CMBA 与木瓜蛋白酶（papain，PaP）分子对接 操作流程按进行。木瓜蛋白酶晶体结构来 自 Brookhaven 蛋 白 质 数 据 库（protein data bank 编 号：1CVZ），利用 PyMOL 软件除去木瓜蛋白酶晶 体结构中与受体结合的原配体分子 C48 和水分子，并对受体蛋白进行加氢加电荷处理。利用 Materials Studio 的功能模块 Discovery 优化对氯苯甲酸 （4-chlorobenzoic acid，PCBA）和 CMBA 的空间三 维结构。利用 AutoDock 4.2 中 AutoGrid 和 AutoDock 两个程序对 PCBA、CMBA 与木瓜蛋白酶分子间的 相互作用进行模拟，并对其柔性受体与刚性配体间 的对接进行计算。对接时，受体大分子的格点盒子 大小为 60 nm×60 nm×60 nm，格点间距为 0.375 nm，盒子中心位于半胱氨酸（cysteine，Cys）25 的 巯基（—SH）上。运用 Lamarckian 遗传算法与局部 能量搜索相结合，利用预设配置对刚性配体分子进行 精确对接，循环次数默认为 10 次。每次循环运算设 定为 100 次独立对接实验，且用半经验势函数作为能 量打分函数，通过计算确定配体分子在受体活性口袋 中可能的结合位置，并将对接结果进行成簇聚类分 析，其均方根（root mean square，RMS）在 2.0 Å 内 的对接结果归为一簇。最终依据最低对接结合能和成 簇分析确定合理的木瓜蛋白酶与CMBA的结合模式， 获得配体与受体蛋白的结合能量和对接作用模式图， 计算氢键距离。

3 结果与讨论

木瓜蛋白酶是一种重要的巯基蛋白，是由 212 个 氨基酸残基组成的含 3 对二硫键的单链蛋白分子，其 一级结构中含 7 个 Cys 残基，其中 6 个形成 3 对链 内的二硫键，另一个Cys25则作为活性位点的巯基。 木瓜蛋白酶具有典型的 α+β 折叠结构，由大小相当 的左右 2 个结构域构成，2 个结构域构成的裂隙为催 化活性中心，含有如下保守氨基酸残基组成的催化 三联体：Cys25- 组氨酸（histidine，His）159- 天冬 酰胺（asparagine，Asn）175。其中，左结构域（L域）由 10~111 和 208~212 氨基酸残基组成，主要是 α螺旋结构，而右结构域（R- 域）由 1~9 和 112~207 氨基酸残基组成，基本是 β- 折叠结构。SRCD 光 谱在光强度、偏振性和准直性方面均优于常规的圆 二色谱，尤其在 190 nm 以下短波长区域，能观察 到更多细致的蛋白质二级结构。通过 CDPRO 中 SELCON3, CDSSTR 和 CONTINLL 三个软件进行重 复拟合，确定最佳分析拟合软件程序为 SELCON3。 SELCON3 软件中选用的 IBasis6 算法可使实验值与 计算值的均方根差和标准均方根方差皆小于 0.1，适用于木瓜蛋白酶二级结构模拟拟合。 远紫外区（178~250 nm）是肽键的吸收峰

4 结语

利用 SRCD 和荧光光谱分析方法，结合 分子模拟技术研究了模拟生理条件下浓度为 1×10-4 mol/L 的 CMBA 对木瓜蛋白酶的作用机理。SRCD 和 Trp 荧光光谱分析结果表明，经 CMBA 处理前后木 瓜蛋白酶的构象和二级结构成分发生变化，一定程度 上揭示了 CMBA 作用下木瓜蛋白酶蛋白构象转变的 机理。利用分子模拟研究 CMBA 和木瓜蛋白酶所形 成复合物的形态，利用成簇聚类分析判定两者间的最 佳作用模式，进一步分析对接结果揭示了 CMBA 与 木瓜蛋白酶发生的相互作用，CMBA 与木瓜蛋白酶 活性中心 L- 域的 Gly66 和 Trp26 残基间存在的氢键 和疏水作用，使 L- 域遭到破坏，导致 α- 螺旋结构 含量急剧降低，β- 结构含量增加，最终酶结构趋向 离散，天然构象遭到破坏，荧光猝灭，木瓜蛋白酶 失活。光谱表征分析和分子对接理论研究结果一致， 两者相互补充，能够从实验和理论两方面协同研究 CMBA 分子与木瓜蛋白酶之间的相互作用，为今后 进一步开展重金属与生物大分子间的相互作用机理 提供一定的理论依据和参考。



 

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