蚁狮纤溶活性蛋白的发现(博迅生化培养箱使用

0 引言

昆虫穴蚁（Myrmeleon sp），其幼虫俗称蚁狮， 属脉翅目昆虫。具有化瘀通窍、利水通便、退疮 祛痰等疗效，可用于治疗骨髓炎、中耳炎、脉管炎 等。我国对蚁岭幼虫的研究可追溯到明朝，李 时珍在1578年撰写的《本草纲目》中就记载了蚁 狮可入药，其后的很多医书也阐述了蚁狮作为中 药对治疗疾病的功效（周汉辉等，2000），近年来 对蚁狮药用价值的深度开发仍在继续。目前治 疗心血管病的药物多为人工合成的西药，大多具 有难以克服的缺点和不良副作用，而天然药物常 具低毒性无副作用的优点。因此利用蚁狮研发 治疗和预防心血管病的新药，前景极为广阔。

1 材料及方法

1.1 原料与试剂

蚁狮：购自野生活体金沙牛直销店；磷酸二 氢钠：天津市大茂化学试剂厂；磷酸氢二钠：天津 市大茂化学试剂厂；硫酸铵：天津市福晨化学试 剂厂；三（羟甲基）氨基甲烷试剂：天津市大茂化 学试剂厂；盐酸：西陇化工股份有限公司；氯化 钡：上海山浦化工有限公司；乙二胺四乙酸二钠 （EDTA）：天津市大茂化学试剂厂；氯化钠：天津 市大茂化学试剂厂；聚乙二醇10000：天津市大茂 化学试剂厂；D34mm透析袋：上海源叶生物技术 有限公司；氯化钾：天津市大茂化学试剂厂；氢氧 化钠：西陇化工股份有限公司；琼脂糖：GENE COMPANGY；碳酸氢钠：天津市大茂化学试剂厂； 磷酸二氢钾：天津市大茂化学试剂厂；考马斯亮蓝G-250：上海蓝季科技发展有限公司；牛血清蛋 白：北京索莱宝科技有限公司；尿激酶：中国食品 药品检定研究所；牛凝血酶：中国食品药品检定 研究所；牛血清蛋白：北京索莱宝科技有限公司； 无水氯化钙：天津市大茂化学试剂厂；硫酸铜：天 津市大茂化学试剂厂；氯化镁：天津市大茂化学 试剂厂；硫酸锰：天津市大茂化学试剂厂；氯化 锌：天津市大茂化学试剂厂；十二烷基硫酸钠 （SDS）：天津市大茂化学试剂厂；乙二醇-双-(2- 氨基乙醚)四乙酸（EGTA）：上海展云化工有限公 司；L-半胱氨酸酸盐一水：天津市大茂化学试剂 厂；巯基乙醇（βME）：西陇化工股份有限公司；一 水合柠檬酸：天津市大茂化学试剂厂；甘氨酸：天 津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器 有限公司；AUY220电子分析天平：梅特勒-上海； 高速冷冻离心机：热电（上海）科技仪器有限公 司；DHG-9076A型电热型恒温鼓风干燥箱：上海 精宏实验设备有限公司；WFZ—UV-2000型紫外 可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司； 微量移液器：德国Eppendorf公司；博迅生化培养箱：上 海博迅实业有限公司。

2 实验方法

2.1 粗蛋白的提取

将蚁狮从沙子里拣出，洗净，沥干，称量，冰 冻致死；研磨后，加入适量预冷PBS（pH 7.4）浸没 匀浆，4℃浸提24h。取浸提液，4℃，10000r/min条 件下离心15min，去沉淀，合并上清液。采用硫酸 铵盐溶液饱和度的方法，对所得蚁狮粗提液进 行分段盐析，得到0~35%、35%~70%、70%~100% 的目的蛋白，收集沉淀。将各盐析段沉淀分装入 预处理好的透析袋中，先用双蒸水透析4h，再用 Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）透析，透析过程中多次更换缓冲液，直至缓冲液用氯化钡溶液检测不出 白色沉淀为止。透析后加入聚乙二醇进行浓缩， 浓缩后将透析袋中待测液取出，分装后置 4℃保 存备用。

2.2 标准曲线的制定

打开超净工作台，紫外照射 0.5h 后，放入已 准备好的纤维蛋白凝胶平板等实验耗材，用孔径 为0.6cm的已灭菌枪头的较大一端在板上打孔并 提前做好标记。按标记的顺序每孔依次按表2加 入不同浓度的尿激酶溶液各20μL，并留一孔加入 PBS溶液20μL作为阴性对照，待加样完成后，小 心平移将平板取出，用保鲜膜包好，于 37℃恒温 培养箱中孵育20h左右。到时间后取出平板，每 板倒入考马斯亮蓝染液约10mL进行染色，10min 左右，然后先用蒸馏水多次冲洗平板至蒸馏水无 色后，换用洗脱液冲，至溶圈清晰可见即可。用 刻度尺测量溶圈的垂直直径，每孔测量两次，取 平均值，计算出实验所得溶圈的面积。

2.3 纤溶活性的测定

采用纤维蛋白平板法测定提取的蛋白粗提 液是否有纤溶活性。 纤维平板的制作：取 0.6g 琼脂糖于锥形瓶 中，加入 72mLPBS 缓冲液灭菌后冷却至 50℃左 右，再加入3mL牛血纤维蛋白原、120μL凝血酶， 迅速摇匀并倒平板，将倒好的平板 4℃保存备 用。检测时取出平板，用 200μL 枪头打孔后加 样，放入 37℃恒温培养箱培养 24h，再进行染色、 脱色，如有纤溶活性，即可观察到蓝色平板上的 透明溶圈。

2.4 蛋白浓度的测定

蛋白浓度测定使用BCA蛋白定量法，以牛血 清白蛋白(BSA)作为标准参照物。 稀释BCA标准品：与待测蛋白样品相一致的 稀释液按表1稀释BCA标准品。

3 结论

采用硫酸铵分段盐析法分离提取出蚁狮纤溶活性蛋白，通过纤维平板法检测，发现 0%~35%、35%~70%、70%~100%三个段的蚁狮的 粗蛋白都具有与 UK 相媲美的纤溶活性，甚至高 于 UK。蚁狮粗蛋白经一系列理化性质研究，结 果表明，最适温度为37℃，最适pH为6。



 

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