萃取部位的抗肿瘤作用研究-HHS-11-2使用

近年来，恶性肿瘤的发病率和病死率均逐年上升， 癌症已成为我国居民的第一位死亡原因，疾病负担沉重 。目前，临床上使用的抗肿瘤药普遍存在治疗窗窄、 药品不良反应相对较大、采用冲击疗法易导致过量中毒 等问题。而研究发现，一些天然药物能够抑制肿瘤的 生长，对肿瘤的转移和复发有一定的抑制效果，且对放 疗、化疗具有“增效减毒”的作用 ，具有较大的开发研究 价值。三脉菝葜（Smilax trinervula Miq.）为菝葜科菝葜 属植物，主要分布于我国江西、浙江、福建等地，亦分布 于日本 。

1 材料

1.1 仪器

MK-Ⅱ型酶标仪、3111 型二氧化碳培养箱（美国 Thermo Scientific 公司）；TS100-F 型倒置显微镜（日本 Nikon 公司）；RE-5205 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪 器厂）；DZF-6030B型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有 限公司）；HHS-11-2型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；TDZ4A-WS型低速台式离心机（长沙湘仪离心 机仪器有限公司）；SW-CJ-2F 型洁净工作台（苏州安泰 空气技术有限公司）；BS124S型万分之一天平[奥多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 药品与试剂

三脉菝葜药材于 2016 年 9 月份采自江西省宜丰县 黄岗山垦殖场，由江西中医药大学黄慧莲教授鉴定为百 合科植物三脉菝葜（S. trinervula Miq.）的根茎；DMEM 高糖培养基（美国 Hyclone 公司，批号：AAJ207791）；胎牛血清（浙江杭天生物科技股份有限公司，批号： 20170124）；MTT（批号：303HC510）、试验用顺铂粉末 （批号：320B022，纯度：≥98.5％）、胰蛋白酶-EDTA消化 液（批号：20170623）、青链霉素混合液（100×）（批号： 20170625）、二甲基亚砜（DMSO，批号：20180608）均购 自北京索莱宝公司；试验用环磷酰胺粉末（上海阿拉丁 生化科技股份有限公司，批号：L1729054，纯度：97％）； 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂均购自国药集团 化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.3 动物

健康SPF级KM小鼠，♂，体质量（20±2）g，90只， 由江西中医药大学动物实验中心提供，实验动物生产许 可证号：SCXK（赣）2018-0003。小鼠购入后，SPF级标准 饲养，饲养和实验期间予以自由摄食和饮水，并观察小 鼠饮食和毛发状况。饲养和实验期间的操作符合国家 科学技术部颁布的《实验动物管理条例》。

1.4 细胞株

人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株A549、人乳腺 癌细胞株 MCF-7 和 MDA-MB-231、人宫颈癌细胞株 HeLa、人卵巢癌细胞株 HO-8910 以及小鼠肉瘤细胞株 S180均来源于中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

2 方法

2.1 三脉菝葜醇提取物及其各极性部位萃取物的制备

称取干燥的三脉菝葜根茎14 kg，切碎，用70％乙醇 加热回流提取3次，每次1 h，过滤后合并滤液，减压浓缩 至无醇味，得到三脉菝葜提取物总浸膏 740 g（得率： 5.286％）。取总浸膏675 g混悬于适量的蒸馏水中，依次 用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压浓缩后分别 得到三脉菝葜醇提物各部位萃取物浸膏：石油醚部位萃 取部位 5.5 g（得率：0.043％）、乙酸乙酯部位萃取部位 65.9 g（得率：0.516％）、正丁醇萃取部位 123 g（得率： 0.963％）；并将余下的水液减压浓缩，得到三脉菝葜醇提 物水层部位372.2 g（得率：2.915％）。

2.2 待测样品溶液的制备

根据预试验结果，分别称取三脉菝葜醇提物浸膏 200 mg、醇提物石油醚萃取部位和醇提物乙酸乙酯萃取 部位浸膏各50 mg、醇提物正丁醇萃取部位浸膏100 mg 和水层部位浸膏 200 mg，置于 1 mL 不同量瓶中，用 DMSO溶解并定容至1 mL，得到不同质量浓度（均以浸膏量计）的母液：三脉菝葜醇提物为200 mg/mL、醇提物 石油醚萃取部位和醇提物乙酸乙酯萃取部位均为 50 mg/mL、醇提物正丁醇萃取部位为100 mg/mL、醇提物水 层部位为 200 mg/mL。取上述母液，用 0.22 μm 微孔过 滤器过滤后，置于4 ℃冰箱中保存，备用。临用前，取适 量溶液用完全培养基（含1％青链霉素混合液和10％胎 牛血清的高糖DMEM培养基）稀释到所需质量浓度。

2.3 细胞培养

从－80 ℃冰箱中取出各细胞株，将冻存管置于 37 ℃水浴锅中水浴约1 min，完全解冻后，转入含5 mL 完全培养基的离心管中，以1 000 r/min离心3 min，弃上 清液，加入6 mL完全培养基，置于37 ℃、含5％CO2培养 箱中培养，复苏后24 h更换培养基，之后每2～3 d对细 胞进行一次传代，细胞传代2次以上可用于试验。

3 结果

三脉菝葜醇提物及其不极性萃取部位对6种肿瘤细 胞的抑制作用均呈现明显的量-效关系。其中以三脉菝 葜醇提物乙酸乙酯萃取部位对肿瘤细胞的增殖抑制作 用最强，对各肿瘤细胞的IC50在40～210 μg/mL之间，其 对 MCF-7 细胞的 IC50为 70.56 μg/mL，对 MDA-MB-231 细胞的 IC50为 83.58 μg/mL，对 HeLa 细胞的 IC50为 44.67 μg/mL，这提示三脉菝葜的抗肿瘤有效成分可能集中在 醇提物乙酸乙酯萃取部位。但与传统的抗肿瘤药物顺 铂相比，三脉菝葜醇提物及其各极性萃取部位对6种肿 瘤细胞的IC50均较高。

4 讨论

采用 MTT 法，考察了三脉菝葜醇提物及其不极性萃取部位对人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株 A549、人乳腺癌细胞株 MCF-7、MDA-MB-231、人宫颈 癌细胞株HeLa和人卵巢癌细胞株HO-8910在内的共计 6种肿瘤细胞株的增殖抑制作用，初步筛选了三脉菝葜 醇提物的抗肿瘤活性部位。结果发现，三脉菝葜醇提物 乙酸乙酯萃取部位的细胞增殖抑制效果最强，呈现明显 的量-效关系，并且三脉菝葜醇提物乙酸乙酯萃取部位 对人乳腺癌细胞 MCF-7（IC50 为 70.56 μg/mL）、MDAMB- 231（83.58 μg/mL）和人宫颈癌细胞 HeLa（44.67 μg/mL）的体外增殖表现出较好的抑制效果，这提示三 脉菝葜抗肿瘤活性成分可能集中在三脉菝葜乙酸乙酯 萃取部位。结合相关研究结果发现，三脉菝葜与菝葜科 其他属植物的抗肿瘤活性部位相一致，但三脉菝葜醇提 物乙酸乙酯萃取部位对肿瘤细胞的抑制效果强于菝葜 科其他属植物的乙酸乙酯萃取部位（IC50大多在 100～ 300 μg/mL 之间）。