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反流性食管炎 ( reflux esophagitis，ＲE) 是胃 液或混合肠液反流刺激等原因引起的食管黏膜炎性 病变，可导致食管黏膜出血、食管狭窄、吞咽困难等。近年来，ＲE 的发病率有不断上升的趋势， 其并发症 Barrett 食管、食管腺癌等已成为消化领 域的研究热点。目前一过性食管下括约肌松弛 被认为是引起 ＲE 的最主要因素，可能与平滑肌细 胞中的游离 Ca2 + 浓度有关。另外，亦有研究显示，5-羟色胺 ( 5-HT) 是参与调节胃肠道运动 和分泌功能的重要神经递质。ＲE 属于中医学 “吞 酸” “吐酸” “嘈杂” “胃脘痛” “食管瘅”等范 畴。研究显示，旋覆代赭汤治疗 ＲE 疗效显著。 本研究观察旋覆代赭汤对食管平滑肌细胞 ( ESMC) 中 5-HT、Ca2 + 的影响，探讨旋覆代赭汤治疗 ＲE 的可能作用机制。
1 材料与方法
1. 1 动物
SPF 级雄性 Wistar 大鼠 45 只，8 周龄，体质 量 ( 220 ± 20) g，由浙江中医药大学实验动物中 心提供，实验动物合格证号: SCXK ( 沪) 2013- 0016。本研究通过浙江中医药大学伦理委员会审 批，批件号: ZSLL-2016-130。
1. 2 药物
旋覆代赭汤根据其在 《伤寒论》中原方的剂 量换算: 旋覆花 15 g，赭 石 5 g，清 半 夏 15 g， 生姜 25 g，人参 10 g，炙甘草 15 g，大枣 15 g，由 浙江中医药大学门诊部提供，水煎浓缩成含生药量 1 g /ml 的药液，置冰箱中 4℃保存。
1. 3 主要试剂及仪器
胎牛血清 ( 批号: 20150520) ，杭州四季青生 物工程材料有限公司; DMEM 培 养 基 ( 批 号: 1897299) ，Sigma 公司; 平衡盐溶液 ( Hanks 液， 批号: 20170331) ，吉诺生物医药技术有限公司; 磷酸缓冲盐溶液 ( PBS，批号: 02 /2019) 、CCK-8 试剂盒 ( 批号: D824FD0251) 、大鼠蛋白激酶 A ELISA 试剂盒 ( 批号: 201710) ，均购自上海生工 生物工程有限公司; FITC-羊 抗 兔 IgG ( 批 号: BST12E02A05 ) 、 FITC-羊 抗 小 鼠 IgG ( 批 号: BST12E02A01) 、5-羟色胺 4 受体 ( 5-HT4Ｒ) 抗体 ( 批号: 003112A81113) 、兔抗大鼠 α 平滑肌激动蛋 白 ( α-SMA， 批 号: 4A4 ) 、 羊 血 清 ( 批 号: 13B01A09) 、DAPI 染液 ( 批号: 12D20B77) 、4% 多 聚甲醛 ( 批号: 12G30B69) ，武汉博士德生物工程 有限公司; 马来酸替加色罗 ( 批号: 189188-57-6) ， 上海陶素生化科技有限公司 ; GＲ113808 ( 批号: 3A/203952 ) ， TOCＲIS 公 司; Forskolin ( 批 号: 15771 ) 、 SQ22536 ( 批 号: 22969 ) ， Medchem Express 公 司; 大 鼠 cAMP ELISA 试 剂 盒 ( 批 号: 1803251) ，上海西唐生物科技有限公司; 免疫染色 通透液 ( 0. 2% Triton X-100，批号: P0096) 、钙离 子荧光探针 ( Fluo-3 /AM，批号: 09011711207) ，上 海碧云天 生 物 技 术 有 限 公 司; 水 合 氯 醛 ( 批 号: I1607002) ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 上海博迅BSC-1000A2生物安全柜； 3111 型细胞培养箱、Heraeus Multifuge X1Ｒ 型 高速离心机，Thermo 公司; 30050303 型多功能酶 标仪，TECAN 公司; DS-Ｒi2 型高级分析倒置显微 镜，Nikon 公 司; LSM880 型 激 光 共 聚 焦 显 微 镜， ZEISS 公司。
1. 4 原代细胞提取
采用随机数表法取 5 只大鼠用于分离正常大鼠 原代 ESMC，实验前大鼠禁食未禁水 24 h，10% 水合氯醛 0. 35 ml /100 g 腹腔注射麻醉，腹部正中 剪开，暴露腹腔，分离食管下端，剪断并获取食管 下 1 /3，立即放入呈有 PBS 的培养皿中。将培养皿 移入超净台内，用 PBS 冲洗 3 次，剥离食管黏膜、 浆膜等杂质。转移呈有 DMEM 的培养皿中，将其 剪成约 1 mm2 的小块。再用巴氏吸管将组织悬液移 入 15 ml 离心管，室温 800 r /min 离心 5 min，离心 半径 8 cm。离心完毕，弃去上清液，加入约 2 ml 含 FBS 重 悬 组 织，移 入 25 cm2 培养 瓶 中，吸 去 FBS，将培养瓶倒置于 37℃ 5% CO2 培养箱中静置培养 4 ～ 5 h，待组织牢固贴于培养瓶上，加入 20% FBS DMEM 培养基 3 ml 培养，隔 3 天换 1 次液。
2 结果
原代培养的 ESMC 培养 3 ～ 4 天有少量细胞从 组织块周围爬出，2 周时细胞生长为单层，铺满瓶 底，细胞形态不规则，成梭形、三角形或菱形，4 周时细胞排列致密，呈 “峰谷样”生长。ESMC 中 α-SMA 呈阳性，细胞纯度较高。在 5% 、10% 、20% 、30% 药物浓度 下，旋覆代赭汤低、中剂量组对 ESMC 干预后 OD 值较空白组均升高 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ，而旋 覆代赭汤高剂量组仅在 5% 浓度下 OD 值较空白组 升高，并 且 在 30% 浓 度 下 OD 值 较 空 白 组 降 低 ( P ＜ 0. 01) 。旋覆代赭汤低剂量组在 5% 、10% 、 20% 、30% 药物浓度下增殖率分别为 188. 68% 、 152. 49% 、168. 36% 、137. 5% ，旋覆代赭汤中剂 量 组 分 别 为 153. 28% 、 155. 66% 、 138. 12% 、 132. 73% ，旋覆代赭汤高剂量组分别为 168. 24% 、 122. 07% 、84. 13% 、71. 80% ，提示 5% 旋覆代赭 汤低剂量组对 ESMC 的增殖作用最强，故选取用于 后续实验。与空白血清组比较，中 药 组、5- HT4Ｒ 激动剂组和 5-HT4Ｒ 抑制剂组的 5-HT4Ｒ 荧光 强度显著增加，中药组和 5-HT4Ｒ 激动剂组、AC 激动剂组 Ca2 + 荧光增强比值及 cAMP 浓度显著增 加 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。与 5-HT4Ｒ 激动剂组比 较，5-HT4Ｒ 激动剂加中药组 Ca2 + 荧光增强比值增 加( P ＜ 0. 0 1 ) 。与AC激 动 剂 组 比 较，AC激 动 剂加中药组 5-HT4Ｒ 荧光强度、Ca2 + 荧光增强比值显 著增 加 ( P ＜ 0. 01) 。与 5-HT4Ｒ 抑制 剂 组 比 较， 5-HT4Ｒ抑制剂加中药组 5-HT4Ｒ 荧光强度、Ca2 + 荧 光增强比值、cAMP 浓度均增加 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。与 AC 抑制剂组比较，AC 抑制剂加中药组 5-HT4Ｒ 荧光强度、Ca2 + 荧光增强比值、cAMP 浓 度均增加 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。
3 讨论
中医学认为，ＲE 多由于素体禀赋不足或饮食 不节、情志失调、久病不愈、劳倦内伤等引起脾胃 虚弱，中焦气机升降失常，气机痞塞，而见心下痞 闷; “脾宜升则健，胃宜降则和”，胃气因虚上逆， 又兼嗳气、反胃、呃逆、反酸等症。病机多属于脾 胃虚弱，痰阻气逆，升降失常，故顾护脾胃、调畅 气机为其基本治则，常用旋覆代赭汤治疗本病。我 们前期研究发现，旋覆代赭汤能够干预 ＲE 的 发生发展，可修复钙离子通道，引起胞内 Ca2 + 浓 度升高，提高食管平滑肌张力，但通过何种途径仍 未明确。
