脾虚小鼠感染念珠菌分析-博迅灭菌器的使用！

白色念珠菌是一种条件致病性真菌，通常情况 寄生于人体的口腔、肠道、阴道以及皮肤的表面。念 珠菌的存在与机体的微生物（如细菌、病毒等）是处 于共生互利的状态，但当人体患有某些疾病（如肿 瘤、癌症、糖尿病等）时，免疫功能的降低易引起菌 群失调，甚至会引起呼吸、消化等功能的异常。近 些年感染系统性白色念珠菌的越来越多，其原因颇 多，例如激素、使用免疫抑制剂包括大量使用一些抗 肿瘤等药物，致使机体对抗白色念珠菌的感染能 力下降，致使菌群失衡患者的发病率及病死率显著 上升。

1 实验材料

1.1 实验药物

四君子汤（人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g）， 购买于沈阳市皇姑区成大方圆药房，依照传统的方 法将其制成水煎制剂。先将中药用蒸馏水浸泡 2 h， 加热煮沸改为文火 15 min，滤出药液，再次加入蒸馏 水煎 20 min，将 2 次药汁混匀，放置 4 ℃冰箱。 甘蓝洗净放好，肥猪油用锅熬制好，放置 4 ℃冰 箱。 氟康唑胶囊，石家庄四药有限公司产品，批号： H10970299。生理盐水将其溶解之后制成混浊液， 调整至药物浓度为 0.4 mg/mL（10 mg/kg）。 白色念珠菌的菌株是由北京大学第一医院赠 与，Candida albicans（03382 株）。

1.2 实验动物

小鼠购买于辽宁长生生物科技有限公司的 SPF 级昆明种，实验动物的生产许可证号为：SCXK（辽） 2010-0001。将购买的实验动物饲养于具有 SPF 级 动物室的实验中心内，即辽宁中医药大学动物室的 许可证号：SYXK（辽）2013-0009。 1.3 试剂与器材 anti-IFN-γ：abcam 公司产品，批号：ab24979。 Western-blot 试剂均购于碧云天生物技术有限 公司，其中包括：标准蛋白质分子量，批号：P0062； 蛋 白 标 准，批 号：P0007；BCA 蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒，批 号：P0012；Western 及 IP 细 胞 裂 解 液，批 号： P0013；SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒，批号：P0012A； Western-blot 蛋白上样缓冲液，批号：P0015L；超敏 ECL 化学发光液试剂盒，批号：P0018；Western- 抗 体稀释液，批号：P0023A。 电子天平选用上海舜宇恒平科学仪器（JA2003 型），生物安全柜选用青岛海尔特种电器（HR40- IIA2 型），上海博迅YXQ-75SII立式压力蒸汽灭菌器，全自动凝胶图像分析选用上海天能 （Tanon-4200SF 型）。

2 实验方法

2.1 接种菌液的配制

在高温高压灭菌后的沙堡培养基上将白念 珠菌株转种培养 2~3 次，放入 37 ℃恒温箱中培养 24 h。选用无菌生理盐水将其转种后的念珠菌 进行稀释，取一滴稀释好的悬液滴在 16×25 计 数板上，然后进行计数，最终将菌液调整为 2× 108 CFU/mL。

2.2 分组、制造模型及处理方法

正常饲养 1 周后，采用随机分成法将小鼠分 为 5 组，即空白对照组（A）、脾虚模型组（B）、脾 虚 + 白念珠菌组（C）、脾虚 + 白念珠菌 + 氟康唑 组（D）、脾虚 + 白念珠菌 + 四君子汤组（E），每组 10 只。除空白对照组（A）10 只小鼠以外，其余参 照文献将采用复合因素法制备脾虚模型，单日 游泳直到耐力极限，身体蜷缩，喂生甘蓝，正常饮 水，双日灌胃猪油 0.5 mL/ 只，连续造模 14 d。参 照脾虚造模诊断的宏观标准对脾虚模型小鼠 进行评估。若模型小鼠出现体重降低，肛门周边 有稀便甚至出现便溏，食少纳呆，疲乏无力，毛色 枯槁，卷缩扎堆等表现，提示脾虚制造模型成功。 造模成功的次日经口感染白念珠菌悬液给 C、D、 E 组的小鼠 0.5 mL/ 只（浓度为 2×108 只 /mL），而 A、B 组给以 0.5 mL/ 只生理盐水。

2.3 给药方法

经口感染白色念珠菌的次日开始灌胃治疗，脾 虚 + 白念珠菌 + 氟康唑组（D）小鼠给予氟康唑灌胃 治疗，脾虚 + 白念珠菌 + 四君子汤组（E）组小鼠给 予四君子汤灌胃治疗。每日 1 次，连续 2 周。

2.4 指标检测

2.4.1 观察四君子汤对脾虚小鼠感染白色念珠菌后

小肠组织中IFN-γ含量的影响 治疗的第 14 天断髓处死后取出小鼠小肠的空 肠 段 0.1 g，用 PBS 冲 洗 干 净，放 置 于 1.5 mL EP 管 中，-80 ℃冰箱冻存备用。提取每组小鼠小肠组织 中总蛋白，采用western-blot法检测其IFN-γ蛋白含 量的表达。首先检测其蛋白浓度，根据蛋白浓度，用 上样液调整好上样的量，最终蛋白的量为15 μg/孔， 在电压 80 V/120 V 条件下开始跑胶，大约 2 h 左右， 关闭电源。将蛋白质从凝胶转移至滤膜上，采用湿 转，100 V 转移 1.5 h。抗原抗体∶一抗（1∶500）、二 抗（1∶1500）放置在 4 ℃冰箱里进行孵育过夜后，第 2 天显色，等体积的 ECL 每膜 1 mL，用自动凝胶图像 分析系统进行拍摄，测其条带的灰度值，将其数统计 分析。

2.4.2 观察四君子汤对脾虚小鼠感染白色念珠菌后

小肠组织中IFN-γmRNA含量的影响 治疗的第 14 天断髓处死后取出每只小鼠小肠 的空肠段 0.1 g，用 PBS 冲洗干净，放置于 1.5 mL EP 中，-80 ℃冰箱冻存，待检。对每组小鼠小肠组织中 IFN-γmRNA 的含量选用 RT-PCR 法进行检测。首 先进行总 RNA 提取，及 RNA 浓度和纯度测定，之后 进行 cDNA 的逆转录合成和 PCR 反应，最后用琼脂 糖凝胶进行电泳。将凝胶成像用全自动凝胶图像分 析系统进行分析，测定每条条带的积分光密度值，记 录数据统计分析。2.5 统计学方法 对每组数据选用 SPSS10.0 统计软件进行分析。 小鼠肠组织当中的 IFN-γmRNA 及蛋白含量采用 x —±s 表示，P<0.05 被认为有显著性差异。

3 实验结果

如实验结果示：与 A 组比较，B 组蛋白表达 水平显著升高（P<0.05），C、D、E 组小鼠肠组织 当中 IFN-γ 蛋白的含量在治疗后均显著升高 （P<0.01）。 与 B 组 比 较，C 组 小 鼠 小 肠 组 织 中 IFN-γ 蛋白的含量显著升高（P<0.01），D、E 组小 鼠小肠组织中 IFN-γ 蛋白的含量在治疗后均升 高（P<0.05）。与 C 组比较，D 组、E 组鼠小肠组织 中 IFN-γ 蛋白的含量在治疗 14 d 后均无统计学 意义。与 D 组比较，E 组小鼠肠组织当中 IFN-γ 蛋白的含量在治疗 14 d 后无统计学意义。如实验结果示：与 A 组比较，B、C、D、E 组小鼠 肠组织当中 IFN-γmRNA 的含量在治疗后均明显 升高（P<0.01），具有统计学意义。与 B 组比较，C、D、 E 组小鼠肠组织中当 IFN-γmRNA 的含量在治疗后 均升高（P<0.01），具有统计学意义。与 C 组比较，D 组、E 组小鼠小肠组织中 IFN-γmRNA 表达水平均 无统计学意义。

4 讨论

“内伤脾胃，百病由生”，脾居中焦，主运化水谷 精微，气血生化之源，气机升降之枢纽。若脾脏 出了问题，即不能化生气血，升降功能又失调，就会 影响正气。一些研究者发现，中医脏象学描述的 “脾”，从它的位置、形态上来看，实际就是我们现代 解剖学中的脾和胰等，而且这些组织和器官都是帮 助机体消化、提高机体免疫功能的器官和组织学基 础，因此说明脾有防御功能，若脾气虚弱导致防 御能力下降，则“百病由生”。而脾虚证大多指的 是脾气功能不足、不能运化、失其健运等。四 君子汤为经典治疗脾虚方剂，对于肠道菌群失调研 究也颇多。而目前研究者发现，白色念珠菌的易 感染性与机体的免疫防御功能有关，当机体免疫功 能降低时发生白色念珠菌感染，会引起机体内细胞 因子含量的变化，部分疫功能也受到一定程度的抑制。