立式蒸汽灭菌器对气道炎症的作用研究的使用

咳嗽是人们日常生活中常见的一种现象，它是人体的 一种应激反应，目前，其发病机制尚不完全明确，相关文献 报道称咳嗽或者与气道炎症反应、气道黏膜损伤等因素有干系。呼 吸 道 合 胞 体 病 毒 ( respiratory syncytial virus， ＲSV) 是一种常见的冬季呼吸道病毒，影响所有年龄段的 人，是幼儿严重下呼吸道感染的主要原因。然而，ＲSV 在成 人中也是一种重要的病原体，特别是在老年人、慢性肺部疾 病患者或免疫功能受损的人群中。现代医学认为病毒 感染导致了气道变应性炎症、气道上皮损伤、气道高反应等。

1 材料与方法

1． 1 实验动物

清洁级豚鼠，雌性，体质量 300 ～ 450 g，购自北京实验 动物中心，动物使用许可证号: SYXK( 辽) 2012 － 0003。

1． 2 主要试剂及仪器

1． 2． 1 射干及提取物制备

射干药材购自亳州市星跃药 业有限责任公司，由辽宁中医药大学植物教研室王冰教授 鉴定为鸢尾科射干 Belamcandachinensis( L． ) Ｒedouté 的干 燥根茎。射干提取物的制备: 取射干片加 70% 乙醇，回流 提取 3 次，第 1 次加 8 倍量，第 2 次和第 3 次分别加 6 倍 量，每次提取 1 h，趁热滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩成 稠膏，干燥，粉碎成细粉。

1． 2． 2 试剂

肺宁片购自吉林吉春制药股份有限公司 ( 20140206) ; Hep － 2 人喉表皮癌细胞购自江苏齐氏生物科 技有限公司; ＲSV 由中科院武汉病毒所赠予; DMEM 培养 液和胎牛血清购自 COＲNING 公司; DMSO 购自美国 Sigma 公司; 胰酶和青链霉素购自中国医学科学院生物工程研究 所; 色谱级醋酸铵、色谱级甲醇和色谱级乙腈购自德国默克 公司; Cis － 5，8，11，14 － Eicosic Acidtraenoic Acid ( AA) ( 批 号: U － 71A － F2 － Z) 和 Arachidonic Acid － d8 ( AA － d8) ( 批号: 0465985 － 16) 购自美国 Cayman Chemical 公司。

1． 2． 3 主要仪器

喷雾仪( EM99 － 002，惠州斯莱达) ; 全 自动模块式血液体液分析( XN － 1000，日本 Sysmex 公司) ; 熏烟箱( 自制) ; 三气培养箱( CB210，德国 Binder) ; 倒置荧 光显微镜( XDS － 500C，上海蔡康) ; 超净工作台( SW － CJ － 2D，苏州净化) ; 低速离心机( BY － 400C，北京白洋) ; 立式蒸汽灭菌器( BXM-30R，上海博讯) ; LC － MS /MS 联用仪 ( Agilent6410 型，美 国 Agilent) ; 微型旋涡混合仪 ( XW － 80A，上海沪西) ; 分析天平( XS105，瑞士 Mettler － Toledo) ; 超纯水机( Milli － Q，德国默克) 等。

1． 3 实验方法

1． 3． 1 病毒培养

Hep － 2 细胞在培养瓶中长至 70% ～ 80% 融合，吸出培养基，取病毒悬液 100 μL 接种于细胞上， 吸附 2 h 后倒出病毒液，加入 5% 胎牛血清的培养基，于第 2 ～ 3 天开始出现细胞病变( CPE) ，待病变达 60% ～ 70% 时 收获病毒，细胞病变法( cytopathic effect，CPE) 测定病毒感 染滴 度，Ｒeed － Muench 公式计算病毒半数细胞感染量 ( TCID50 ) 。1 TCID50≈0． 7 空斑形成单位( plaque forming unit，pfu) 。

1． 3． 2 感染后咳嗽模型的制备

将豚鼠放入自制 450 mm × 450 mm × 900 mm 熏笼中，每 5 只 1 笼，以锯末 50 g + 10 支香烟点燃烟熏，每次 30 min，每日 1 次，连续 7 d，自由 进食吸水，分别在第 2 天、第 3 天用乙醚浅麻醉 1 次，鼻腔 滴入已事先扩增冻存好的病毒液，病毒滴度为 8 × 106 pfu / mL，滴入量以体质量 1 μL/g 计算。

1． 3． 3 实验动物分组及给药方法

将 40 只 SPF 级豚鼠适 应性饲养 1 周后，随机分为 4 组，即空白组、模型组、射干组 ( 600 mg·kg － 1 ·d － 1 ) ，阳性组( 肺宁片 512 mg·kg － 1 ·d － 1 ) ，每组 10 只。按“1． 3． 2”制备感染后咳嗽动物模型， 除模型组外，其它各给药组在第 8 天时开始给药，每天 1 次，连续给药 7 d，空白组给予等体积生理盐水。

1． 3． 4 对实验动物镇咳作用的观察

于末次给药 45 min 时，将动物置于 5 L 大烧杯中，底部加少量垫料，烧杯口用 保鲜膜封，以 4． 5 mol /L 枸橼酸溶液雾化吸入激发，每次 30 s，观察 5 min 内豚鼠咳嗽次数。

2 结果

除空白组外，各组的肺组织均浆液在 Hep － 2 细胞上 培养至第 2 天细胞开始逐渐肿胀、变圆和聚集，细胞间隙增 大，第 4 天形成多核巨细胞或称融合细胞。提示 ＲSV 病毒 感染成功。模型组豚鼠的咳嗽潜 伏期无显著差异( P ＞ 0. 05) ，而 5 min 内咳嗽次数显著高于 空白组( P ＜ 0. 01) ，提示造模成功。与模型组相比，给药组 中，射干组和阳性组豚鼠 5 min 内咳嗽次数显著降低( P ＜ 0. 05) ，阳性组豚鼠 5 min 后咳嗽次数显著下降( P ＜ 0. 05) ， 提示射干提取物对豚鼠 ＲSV 感染后气道炎症具有显著的 镇咳作用。空白组镜下肺组织和肺泡结构正常， 有完整的支气管上皮，黏膜较光滑，各层的结构比较清晰， 在支气管壁内侧未见到炎症细胞的浸润; 模型组在镜下观 察到显著地支气管、支气管周围炎症，其血管周围有很多炎 性细胞浸润，观察到支气管黏膜充血水肿，管腔内有上皮细 胞脱落，有纤毛倒伏上皮现象，明显可见中性粒细胞和淋巴 细胞有围管性浸润; 而射干组和阳性组与模型组比较，支气 管和周围炎症较上述病理变化均有所减轻，提示射干提取 物对呼吸道合胞病毒感染后气道肺组织损伤有一定的治疗 作用。

3 讨论

感染后咳嗽又称为“感冒后咳嗽”，是指呼吸道 感染发热等急性期症状消失后，咳嗽仍迁延不愈，可持续 3 ～ 8 周的时间，呈喉痒、干咳或咳少量白色黏液痰，血常规、 C 反应蛋白、胸片提示无异常，是呼吸道感染后常见的并发 症。西医认为该病为自限性疾病，很多权威学者一致认 为炎症因素、气道上皮损伤、气道高反应性、神经因素等是 感染后咳嗽的发病机制，通常经过长时间自行缓解或予经 验性治疗可愈。



 

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