响应面法优化制备牡蛎短肽工艺

牡蛎俗称生蚝、海蛎子，因肉质爽滑，味道鲜 美，营养丰富，被附以“根之源”“海洋牛奶”等 美誉。近年来，我国牡蛎行业产量呈现逐年上升 的趋势，2018 年养殖量达 513.9 万 t 。但是目前 国内牡蛎的应用仍以直接食用或制成调味料为主， 针对其精深加工技术与新型产品开发的进展较为 缓慢，因此，推动牡蛎深加工及综合利用对其产业 的可持续发展具有十分重要的意义。一般来说，3 ~ 9 个氨基酸聚合而成的肽称为短肽，其相对分子 质量范围为180 ~ 1 000，介于氨基酸与蛋白质之间， 具有吸收好、代谢快、活性高等优点，是目前国内 外研究开发的热点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis），体质 量（20.56 ± 1.34）g，购于湛江市东风市场；菠萝 蛋白酶（1.6×104 U/g）、木瓜蛋白酶（7.0×104 U/g）、 动物蛋白酶（6.8×104 U/g）、风味蛋白酶（7.0×104 U/g）、中性蛋白酶（6.3×104 U/g），南宁庞博生物工 程有限公司；Protamex（6.3×104 U/g）、Flavourzyme （5.9×104 U/g），诺维信生物技术有限公司；还原型谷胱甘肽（GSH），上海源叶生物有限公司；混合 氨基酸标准溶液，和光纯药工业株式会社；氢氧化 钠、甲醛等分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-25 雷磁 pH 计，上海康仪仪器有限公司； UV-8000 紫外分光光度计，上海元析仪器有限公 司 ；VAPODEST450 全自动凯氏定氮仪，德国 Gerhardt 公司；L-8900 全自动氨基酸分析仪，日立 高新技术公司；SHZ-水浴恒温震荡器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；冷阱 CT-6、ZLS-1 型真 空离心浓缩仪，湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 牡蛎酶解液的制备

牡蛎全肉经流水解冻 后打浆均匀，按料液质量体积比（g/mL，下同）1∶ 3 加水，调各酶最适 pH 值，8 000 r/min 匀浆 2 min， 加酶酶解后 100 ℃水浴灭酶 10 min，静置冷却至室 温后以 8 000 r/min 离心 15 min，最后四层纱布过滤 获取上清液，在-20 ℃下保存备用。

1.3.2 高效蛋白酶的筛选

选用 Flavourzyme、 Protamex、动物蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，在各自最适条件下进行 酶解（表 1），以水解度、氮 N 回收率、短肽质量 浓度、短肽得率为指标综合评价酶解效果。

1.3.3 前处理对酶解效果的影响

称取牡蛎浆液40 g 放入 250 mL 锥形瓶中，按料液比 1∶3 加蒸馏 水后均质，分别采用热处理（60、70、80、90、100 ℃ 下水浴保温 10 min）和室温 25 ℃下超声波处理（功 率 500 W 处理 10、15、20 min，）两种方式对牡蛎 匀浆液进行预处理，冷却至室温测 pH 值后加入动 物蛋白酶酶解 4 h，最后 100 ℃水浴灭酶 10 min 离 心取上清液，-20 ℃冷冻保存备用。.

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶酶解效果分析

风味蛋白酶的水解度最高为（41.86 ± 3.62）%，动物蛋白酶略低，为（41.37 ± 1.19）%， 两者无显著差异（P > 0.05）。中性蛋白酶的 N 回收 率最高为（84.12±2.18）%，动物蛋白酶次之为（77.53 ± 0.49）%。由图 1B 显示结果可知，动物蛋白酶的 短肽质量浓度和短肽得率均显著高于其他六种蛋 白酶（P < 0.01），分别为（15.68 ± 0.67）mg/mL， 34.79%。不同蛋白酶的酶切位点千差万别导致酶解 效果的大不相同，动物蛋白酶本身是一种复合酶， 它既是内切酶又是外切酶，具有多种酶切位点，故 其酶解产物各项指标利用率高。因此，选取动物蛋白酶为酶解牡蛎的高效蛋白酶，进行下一步实验。

2.2 不同前处理对酶解效果的影响

热处理 10 min 后的动物蛋白酶 酶解产物水解度和 N 回收率均低于未处理，且随着 温度升高，牡蛎酶解产物的水解度和 N 回收率逐步 降低。这可能是因为加热温度过高或时间过长，都 会使已暴露出来的S—H氧化生成S—S或疏水相互 作用导致致密的网状结构形成，导致众多酶切位点 反而被包埋。郭玉华等研究显示热处理温度越 高，牡蛎酶解产物的水解度越低；林海生等研究 表明热处理组水解度均低于未处理组。本研究结 果与其结论相一致。图 2A 显示，酶解产物在 500 W 条件下超声 10、15、20 min 后的水解度和 N 回收 率均低于未处理组。这可能是 500 W 超声波过强且 超声波过程中产热导致牡蛎蛋白质结构被破坏，致 使蛋白酶酶解效率降低。

3 结论

本实验确定牡蛎匀浆液经 80 ℃热处理 10 min后加动物蛋白酶为制备牡蛎短肽的高效方法。确定 最佳酶解工艺条件,即料液比 1∶3.9，酶解温度 47 ℃，动物蛋白酶加酶量 3 300 U/g，自然 pH 下 酶解时间 3 h，此条件下短肽得率达（58.53 ± 1.20）%，比传统工艺的短肽得率提升 24.8%。该回 归模型可靠，说明利用响应面法能有效优化制备牡 蛎短肽的酶解工艺。



 

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