对小鼠脑缺血再灌注损伤分析（博迅水槽使用）

大脑短暂缺血性损伤或再通可见于头颈部手术出现的 并发症，脑血栓形成后部分脑血管的自然再通或者药物溶 栓再通也会出现缺血再灌注损伤。在脑缺血再灌注损伤 时，大脑缺血边缘区( 半暗区) 细胞以凋亡为主要死亡方式， 及时的药物干预可以抑制细胞凋亡，因此该区域为脑缺血 以及再通后重点抢救区域。而海马区对缺血缺氧相当敏 感，及时抢救海马区的神经元凋亡，对保护海马区的记忆、 学习功能有重要意义。

1 实验材料

1. 1 动物

SPF 级健康 6 周龄雌性昆明种小鼠 33 只，体质 量 22 ～ 30g，由广州中医药大学实验动物实验中心提供，许 可证号: SCXK( 粤) 2013 － 0034。自由饮食饮水饲养，自然光 暗周期。

1. 2 药物与试剂

三七总皂苷，云南玉溪万方天然药物有 限 公 司 提 供，规 格: 200mg /支，批 准 文 号: 国 药 准 字 Z20026437; 兔抗小鼠 Bax 和 Bcl － 2 多克隆抗体，CST 公司 提供; SABC 免疫组化染色试剂盒，规格: 1kit，购自武汉博士 德生物试剂公司; DAB 显色试剂盒( 20 × ) ，规格: 3ml，购自 北京索莱宝科技有限公司。

1. 3 主要仪器

光学显微镜( 日本 OLYMPUS 公司) ; 冰冻 切片机( 德国 LEICA 公司) ; 博迅SSW-600-2S电热恒温水槽( 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司) 。

2 实验方法

2. 1 动物分组

将实验小鼠随机分为空白组( 7 只) 、PNS 组( 8 只) 、缺血 9d 组( 9 只) 、缺血 24h 组( 9 只) 。

2. 2 模型制备

PNS 组、缺血 9d 组和缺血 24h 组参照相关中的方法改进制备缺血再灌注模型。称小鼠体质量， 腹腔注射水合氯醛( 0. 003ml /g) 麻醉小鼠，待小鼠无翻正反射 后，固定于手术台上，常规消毒，颈部切开 0. 8 ～ 1cm 正中切 口，剪毛，切开皮肤和皮下组织，钝性分离肌肉，暴露颈动脉 鞘，然后分离双侧颈总动脉及迷走神经约 0. 5 ～ 1cm，并用丝 线穿过颈总动脉下方，提拉丝线，以动脉夹夹闭颈总动脉阻断 血流 20min，然后去除，恢复灌注，最后缝合皮肤，消毒。

2. 3 给药方法

PNS 组于缺血前 3d 开始腹腔注射 PNS 30mg /( kg·d) ，之后每天同一时间注射等体积 PNS，持续 至再灌注第 9 天后取脑。缺血 9d 组和缺血 24h 组均在造模 前 3d 以等体积的 0. 9% 氯化钠注射液腹腔注射，之后每天 同一时间等体积注射 0. 9% 氯化钠注射液，分别持续注射至 再灌注第 9 天和再灌注 24h 后取脑。空白组在缺血 9d 组造 模前 3d 以等体积 0. 9% 氯化钠注射液腹腔注射，之后每天 同一时间注射等体积 0. 9% 氯化钠注射液，持续注射至第 9 天后取脑。

2. 4 观察指标

SABC 免疫组化方法: 获得鼠脑后按冰冻 切片制作方法进行切片，厚度 30μm。按照 SA1020 － 小鼠/ 兔 IgG SABC 免疫组化染色试剂盒说明书进行染色，步骤 为消除组织内源性过氧化物酶、抗原修复、封闭、孵育一抗、 孵育二抗、孵育 SABC、DAB 显色、脱水、透明、封片。其中每 组脑片分别进行 2 次免疫组化染色，分别孵育 Bax 抗体( 工 作浓度 1∶ 800) 和 BCL － 2 抗体( 工作浓度 1∶ 1600) 。其中， DAB 显色法步骤按照 DAB 显色试剂盒( 20 × ) 说明书进行， 具体步骤: 将工作 A 液、B 液、PBS 液按 50∶ 50∶ 900 稀释并混 合，室温避光孵育切片 30min，在显微镜下观察显色，用蒸馏 水洗涤终止反应。 阳性细胞计数: 在 200 倍光学显微镜下在脑组织切片的 海马区内随机选取 5 个视野计数免疫组化染色阳性的细胞 数。并分别记录每组切片 Bax 和 Bcl － 2 免疫组化染色阳性 的细胞数。

2. 5 统计学方法

采用 SPSS 19. 0 统计软件处理数据，2 组 间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，数据以均数 ± 标准差( x ± s) 表示。P ＜ 0. 05 表示差异有 统计学意义。

3 实验结果

各组小鼠海马区 Bax、Bcl － 2 表达水平比较: 与空白组比 较，缺血 9d 组 Bcl － 2、Bax 水平均明显增高; 与缺血 9d 组比 较，PNS 组 Bax 的表达水平明显降低，Bcl － 2 /Bax 的表达水平 明显增高; 缺血9d 组 Bax 和 Bcl － 2 的表达均较缺血24h 组增 高; 差异均具有统计学意义。( 见图 1、图 2) 表 1 各组小鼠海马区 Bax、Bcl － 2 水平比较( x ± s，个) 组别 只数 Bcl － 2 Bax Bcl － 2 /Bax 空白组 7 2. 94 ± 2. 15 4. 00 ± 4. 10 0. 92 ± 0. 52 PNS 组 8 7. 30 ± 3. 75 3. 35 ± 1. 81 2. 26 ± 0. 70cd 缺血 9d 组 9 27. 44 ± 19. 59abd 63. 44 ± 12. 77abd 0. 46 ± 0. 32 缺血 24h 组 9 0. 58 ± 0. 88 1. 58 ± 1. 44 0. 61 ± 1. 11 注: 与空白组比较，a P ＜ 0. 05; 与 PNS 组比较，b P ＜ 0. 05; 与缺血9d 组比较，c P ＜0. 05; 与缺血24h 组比较，c P ＜0. 05。


4 讨 论

PNS 具有广泛的药理作用，实验研究证实其不仅能抑制 炎症因子、清除自由基、抗氧化应激，还能通过活血化瘀、扩 张毛细血管，降低血管阻力及血液黏度，改善微循环，对脑 缺血再灌注损伤有保护作用，因此可用于缺血性脑血管疾 病的治疗。黄小平等将三七的 3 种有效成分人参皂苷 Ｒg1、Ｒb1 以及三七皂苷 Ｒ1 分别与黄芪甲苷配对，然后注入 脑缺血模型小鼠后发现，注入人参皂苷 Ｒg1 的小鼠脑组织 中一氧化氮含量明显降低，说明人参皂苷 Ｒg1 具有抗脑缺 血的作用，对再灌注后氧化应激损伤的亦有明显的保护 作用。



 

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