细胞悬浮培养体系建立（博讯YXQ-50SII灭菌器使用

樟叶越桔 ( Vaccinium dunalianum Wight) 为杜 鹃花科 ( Ericaceae) 越桔属 ( Vaccinium) 植物， 主要分布于我国西南地区，以及越南、不丹、印度 东北部等地。其幼嫩叶芽在云南彝族民间被称为 “雀嘴茶”，据记载自明代开始就作为一种茶代用品饮用至今。程桂广等、杨芳等和罗旭璐 等等先后对雀嘴茶进行了营养成分的分析和评 价，发现雀嘴茶中含有 17 种氨基酸、10 种常量和 微量元素，具有明显的高钾低钠特征，并含有粗纤 维、黄酮类、Vc 和多糖等多种营养物质。近年来，作为 21 世纪天然、安全、高效的美白活性 添加剂的熊果苷，已广泛应用于化妆品等相关 领域。

1 材料与方法

1. 1 材料与试剂

1. 1. 1 植物材料

采用研究组前期培养的樟叶越桔组培苗， 挑选健壮且茎未木质化的瓶苗为试验材料，其原始 植物材料于 2013 年 5 月采自云南省楚雄彝族自治 州武定县。

1. 1. 2 试验试剂及仪器

试剂 WPM 木本植物培养基母液，包括大量元 素组、钙盐组、铁盐组、微量元素组、有机物组; 蔗糖，琼脂，玉米素 ( ZT) ，萘乙酸 ( NAA) ，6-苄氨基腺嘌呤 ( 6-BA) ，2，4-二氯苯氧乙酸 ( 2，4-D) 。 仪器 万分之一电子天平 AＲ224CN 型 ( 上海 奥豪斯 仪 器 有 限 公 司) ，立式压力蒸汽灭菌器博迅YXQ-LS-50 SII 型 ( 上海博讯实业有限公司医疗设 备厂) ，超净工作台 SW-CJ-2FD ( 苏净集团苏州安 泰空气 技 术 有 限 公 司) ，电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9053 型 ( 上海一恒科技有限公司) 。100mL 广口锥形瓶，0. 22μm 无菌透气封口膜，镊子、手 术刀、不锈钢称量勺。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 愈伤组织诱导条件的筛选

配制诱导培养基 采用 WPM 木本植物培养 基，其中添加蔗糖 30g /L，琼脂 4. 5g /L。根据越桔 属其它植物的相关，设计 6-BA、NAA 和 2，4-D 的 4 种激素配比。 取生长健壮、未木质化、叶片大小适中的组培 苗，摘取中靠近顶端的幼嫩叶片，用手术刀在叶片 表面划出若干划痕，每瓶放置 3 片叶片。每组取 5 瓶为光培养，条件为，光照强度 30－50μmol /m2 ·s， 光照周期为 12h /d; 另外 5 瓶为暗培养。培养温度 为 25±2℃。每周观察记录其生长状况，共计观察 8 周。

1. 2. 2 愈伤组织增殖条件的筛选

配制增殖培养基 采用 WPM 木本植物培养 基，添加蔗糖 30g /L，琼脂 4. 5g /L。前期预试验发 现半固体培养基中，ZT 与 NAA 浓度为 5 ︰ 1 时利 于愈伤组织生长。由于高浓度激素有利于促生蓬松 状愈伤组织，而过高浓度反而抑制愈伤组织生长， 故设 计 4 组 浓 度 梯 度，第 1 组 的 激 素 配 比 为 1. 0mg /L ZT + 0. 2mg /L NAA; 第 2 组为 1. 5 mg /L ZT + 0. 3mg /L NAA; 第 3 组 为 2. 0mg /L ZT + 0. 4 mg /L NAA; 第 4 组 为 2. 5 mg /L ZT + 0. 5mg /L NAA，以此探究樟叶越桔愈伤组织适宜的增殖培养 条件。 挑选浅黄色半透明无褐化生长良好的愈伤组 织，切成较小的块，如愈伤组织足够蓬松、大小适 宜，可轻轻掰下，以减少切面损伤，减少后期褐化 现象。转移至新培养基时保持愈伤原有的上下相 位，每瓶培养基接种 4－5 块愈伤组织。采用暗培 养的方式培养，培养温度为 25±2℃。每周观察记 录其生长状况，培养至愈伤组织呈现蓬松状态。

1. 2. 3 悬浮培养体系的建立

配制液体培养基 采用 WPM 木本植物培养基， 添加 蔗 糖 30g /L，激 素 为 2. 0mg /L ZT + 0. 4mg /LNAA，调节 pH 4. 8－5. 2。将培养基分装至 100mL 广口三角瓶中，每瓶培养基 50mL，用 0. 22μm 无 菌透气膜封口。 为探究最适宜转移至液体培养基中建立悬浮培 养体系的愈伤形态，在培养过程中选择不同形态 的、满足前人经验的适宜建立悬浮体系的愈伤组 织，分别转移至液体培养基中进行悬浮培养。包 括:
( 1) 浅黄色表面干燥半透明疏松态愈伤组织;
( 2) 浅黄色半透明颗粒状愈伤组织;
( 3) 能自行 分散成近粉末状的浅黄色半透明愈伤组织。转移至 液体培养基中培养 3 代以上，观察其是否适宜建立 悬浮培养体系。

2 结果与分析

不同激素配比的 A、B、C、D 4 个处理先后均可产生愈伤组织，但随着培养时间 的延长各组愈伤组织的生长状况各有不同，并发现 不同光照条件下诱导的叶片愈伤组织无明显差异。 其中，A 处理和 D 处理最终产生稳定的半透明、 活性较强、褐化现象不明显的愈伤组织，最适宜后 续试验需要。考虑到 A 处理愈伤组织的产生速度 和增殖速度高于 D 处理，且愈伤组织质量差异较 小，故采用 A 处理作为诱导愈伤组织的激素配比。将 A 处理诱导所得的半透明、无褐化、质量 较好的愈伤组织通过继代的方式转移到所设置愈伤 组织增殖的 4 组增殖培养基中，培养至 3 个月，每 组愈伤组织均生长良好，蓬松度较好，但第 3 组的 愈伤组织除呈现半透明蓬松状态，还能在边缘处出 现能自行分散成小颗粒的愈伤组织，其余 3 组其愈 伤组织的蓬松度均不如第 3 组。因此，第 3 组的激 素浓度配比 ( 2. 0mg /L ZT+0. 4mg /L NAA) 最适宜 培养用于悬浮培养的愈伤组织。

3 结论与讨论

植物生长调节剂是影响愈伤组织诱导和增殖的 重要因素。本试验发现樟叶越桔愈伤组织诱导的最 佳配比为 2. 0mg /L 6-BA+0. 05mg /L NAA+2. 0mg /L 2，4-D) ，所诱导出的愈伤组织质量较好，为半透 明黄色，无褐化现象产生。这一结果与同属植物矮 丛蓝莓 ( V. angustifolium Aiton) 叶片诱导愈伤的结 果相符。对高灌蓝莓 ( V. corymbosum Aiton) 的 一些研究表明，6-BA 与愈伤组织的产生和质量呈 正相关关系，当 6-BA 处于高浓度条件下，可 直接从茎段和叶片诱导得到愈伤组织。本试验也取 得类似的结果，当 6-BA 的添加浓度为 2. 0mg /L 和 1. 0mg /L 时，诱导所得的愈伤组织的质量和速度均 优于添加浓度为 0. 5mg /L 6-BA 的情况。ZT 对越桔 属植物组培苗有较好的促生长效果，且 ZT 和 NAA 配合使用能有效地促进愈伤组织的诱导和分化，本试验筛选出的 2. 0 mg /L ZT + 0. 4 mg /L NAA 激素配比条件下得到的樟叶越桔愈伤组织质 量较好并呈蓬松状态，符合后续细胞悬浮培养的要求。



 

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